浙江省丽水市一例输入性新型冠状病毒核酸复阳病例的全基因组序列特征

叶碧峰 王晓光 梅建华 叶灵 倪晓媚 曾永 陈秀英

1丽水市疾病预防控制中心检验检测所，浙江丽水323000；2青田县疾病预防控制中心检验科，浙江丽水323900

冠状病毒是一大类病毒，在近20年中发生了3次由β-冠状病毒引起的人畜共患病[1-3]。自2019年12月首次报道[4]的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）流行以来，直至现在仍在全球大流行。2020年至今，我国采取强有力的措施控制了新型冠状病毒肺炎疫情，但在常态化防控阶段，国内多地出现散发、聚集或多点散发聚集疫情，当地防控部门通过对SARS-CoV-2全基因组序列测定及分析，迅速确定病毒来源，为疫情防控策略的制定以及后续溯源提供了参考依据。浙江省丽水市青田县于2020年12月23日在入院患者应检尽检中发现1例SARS-CoV-2核酸检测复阳病例，通过SARS-CoV-2全基因组序列测定及分析，迅速追踪到毒株来源于欧洲，现报道如下。

对象与方法

一、病例概况

患者，女，58岁，汉族，西班牙马德里归国华侨，于2020年10月30日乘坐飞机从西班牙出发，11月1日到达天津，海关检测SARS-CoV-2核酸阳性，当日送当地医院被诊断为普通型新型冠状病毒肺炎病例，11月10日治愈出院。在天津隔离期满，核酸检测阴性后于11月27日从天津返回青田。12月23日18时，患者因糖尿病到青田县中医院入院检查，接受SARS-CoV-2抗体和核酸检测，抗体IgG阳性，核酸阳性，上报青田县CDC。

二、样本来源

青田县CDC赴现场采样，采集了该患者的咽拭子和深咳痰样本于同一管中，SARS-CoV-2核酸复核阳性，送丽水市CDC进行SARS-CoV-2全基因组序列测定。

三、核酸提取与定量

使用达安基因手工提取试剂盒提取患者咽拭子和深咳痰混合样本中的总RNA，提取方法按试剂盒说明书进行，50μL Elution液收集总RNA。采用SARS-CoV-2荧光定量试剂盒（上海明德生物科技有限公司）定量检测SARS-CoV-2两个基因靶标（ORF1ab和N），并依据荧光强度与核酸浓度推算样本中RNA的含量，检测Ct值为26。

四、全基因组序列测定

利用Ion GeneStudio S5平台对样本开展基因测序。使用Invitrogen试剂盒将RNA反转录为cDNA，通过引物预扩增，基因组DNA长扩增子构建文库：片段化、末端修复、接头连接及纯化、缺口修复片段筛选扩增、文库质控Real-time PCR定量。使用CHEF全自动实现乳液PCR克隆扩增、模板制备、ISP富集和Ion 530芯片上样。芯片加载到Ion S5测序系统上机。实验操作方法按仪器和试剂盒说明书进行。

五、全基因组数据分析

下机数据通过运行SARS-CoV-2 Analysis进行基因组组装，相对于参考基因组的覆盖率在95%以上。序列命名为LS-20201224-QT01。利用全球资源共享数据库Nextclade Nextstrain分析全球各层面的数据，用Nextclade工具将本地全基因序列与参考序列进行比较，查看SARS-CoV-2的变异和进化树。应用MEGA X软件寻找最佳核苷酸替代模型，N-J（Neighbor joint）法构建全基因组进化树，使用核苷酸突变来定义进化支，通过先前构建的Nextstrain树找到进化支的突变，以获得COVID-19交互式传播报告。

结 果

一、全基因突变分析

LS-20201224-QT01序列全长29 815 bp，与武汉参考株（MN908947）序列相比，存在13个核苷酸突变及一段19 bp长度的缺失，位于6 353～6 371区域，属于Orf1ab段。这13个核苷酸变异位点没有聚集性，相对均匀地分布整个基因组，分别为241T、445C、3037T、5170T、6286T、11132T、14408T、21255C、22227T、23403G、26801G、28932T和29645T，多数是近期产生的，相比发生在宿主内的在0～51、中位数为4变异数量，其进化速率较高。

该序列包含了D614G突变，除D614位点外，不含有最近南非和英国报道的新型变异毒株的氨基酸关键性突变位点N501Y和69-70del。输入序列9个核苷酸突变引起的氨基酸变异见表1。

表1 青田输入性新型冠状病毒肺炎病例全基因组序列LS-20201224-QT01的氨基酸变异情况

二、全基因同源性分析

青田SARS-CoV-2全基因组序列LS-20201224-QT01与西班牙马德里66岁男性患者hCoV-19/Spain/MD-IBV-99008729/2020的同源性高达99.8%，和国内武汉hCoV-19/Wuhan-Hu-1/2019参考序列的同源性为99.3%，与中科院武汉病毒所在云南蝙蝠粪便中发现的冠状病毒bat/Yunnan/RaTG13/2013同源性为96.3%，与SARS冠状病毒Tor2的差异比较大，同源性仅为80.8%。

三、全基因进化分析

在全球公开数据库Nextclade中检索发现，青田输入性病例SARS-CoV-2全基因组序列LS-20201224-QT01和武汉参考株序列hCoV-19/Wuhan-Hu-1/2019等我国国内本土病例相关性较远，与多个西班牙收集的序列位于同一个进化分支中（见图1），特征符合L基因型欧洲进化分支B.1.1特点，与英国突变株B.1.1.7分支[5]进化较远。青田序列与BetaCoV/bat/Yunnan/RaTG13/2013形成了sarbecovirus属的一个分支，而SARS-CoV和MERSCoV等病毒构成了另一分支。

图1 青田输入性新型冠状病毒肺炎病例全基因组序列LS-20201224-QT01与欧洲序列系统进化树构建

讨 论

青田是全国著名的侨乡，随着境外疫情不断升级，境外输入确诊病例持续增加。本文病例在到达目的地按规定满14 d解除集中隔离医学观察后，返回丽水，复查核酸呈阴性，26 d后复检核酸呈阳性。从该患者样本中SARS-CoV-2的基因同源性比较结果分析，病毒株与西班牙毒株同源性最高，参考患者暴露史和行动轨迹，考虑为西班牙输入的复阳病例。据报道，欧洲和南非等地病毒突变趋势正在迅速崛起[5-7]。对本文患者病毒样本全基因组序列测定结果显示，序列包含了D614G突变，但不含有最近南非和英国报道的新型变异毒株的氨基酸关键性突变位点。D614可能在患者上呼吸道中具有更高的病毒载量，因此更容易传播给他人，其传播能力可能更强，但疫苗对这一毒株依然有保护效力[7]。

我国目前对SARS-CoV-2基因序列最为通用的分型方法是中国分型法（S/L主分支）和Pangolin分型法（A/B主分支），二者一般结合使用[8]。青田本次的复阳病例经过溯源，结合以上2种方法，与武汉参考株序列hCoV-19/Wuhan-Hu-1/2019等我国国内本土病例序列相比，该毒株为L型欧洲家系B.1.1分支，L型欧洲家系为目前欧美国家及其全球主要流行的家系，我国输入性病例多为该家系。相比更古老的S亚型，L亚型更具侵略性、传染力更强，今后需予以关注。

有报道称复阳病例多为合并基础疾病的患者，尤其是合并糖尿病者最多[9]。本组病例患有糖尿病，是否提示合并糖尿病等基础性疾病患者由于机体免疫力较低，导致机体对病原体的清除延缓，有待进一步观察。鉴于合并基础性疾病的患者在出院后发生复阳现象概率更大，建议出院前后反复多次进行核酸检测，以便及时发现复阳患者。

综上所述，该例输入性复阳病例SARS-CoV-2基因组序列属于L基因型欧洲进化分支B.1.1，为西班牙输入的复阳病例。本文从临床样本中分析SARSCoV-2的基因组，判定病毒的来源，为丽水市进一步监测病毒基因变异提供了一个可行的方案，为本地疫情的风险评估和防控策略的制定提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突