仔猪沙门菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒和圆环病毒混合感染的报道

邓同炜 ， 王成龙 ， 冯兰珠 ， 蒋增海 ， 李文刚

(1.河南牧业经济学院动物医药学院 ， 河南 郑州 450046 ； 2.河南省猪病防控工程技术研究中心 ， 河南 郑州 450046)

仔猪副伤寒，又称为猪沙门菌病，是由鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、猪伤寒沙门菌等多种病原引起的一种重要的人兽共患病[1]。近年来，关于猪繁殖与呼吸综合征病毒与圆环病毒混合感染的报道较多[2-4]，但是由沙门菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒和圆环病毒三者的混合感染报道却极少[5]。笔者于2018年10月接诊1例病猪，通过临床诊断和实验室检测，确定为仔猪沙门菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒和圆环病毒混合感染，报告如下。

1 发病情况

河南省濮阳市清丰县某一自繁自养、中小型猪场，存栏繁殖母猪约30余头。在最近1～2周内，各年龄段的猪只均有发病，尤其母猪和仔猪发病较为严重，其中1头妊娠母猪发病后死亡，另外1头妊娠母猪在怀孕后期产死胎；仔猪的发病数较多，1周之内已经有2头死亡。为了确诊病因，该场养殖户送检1头发病仔猪和几头发病母猪的血清样品到本实验室进行化验检测。经过询问，了解到该猪场未进行猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒疫苗的免疫接种，仅按照要求进行了猪瘟病毒、伪狂犬病病毒等疫苗的免疫接种。

2 临床症状

多数母猪表现为精神不振，体温升高，嗜睡，厌食，所有发病的母猪使用退烧药和青霉素注射后，出现体温反弹，病情不见好转。其中1窝断奶仔猪，总共12头，全部发病，临床症状表现为精神不振，发热，腹式呼吸，拉稀，消瘦，皮肤发白，排出黄色稀便，发病1周左右开始死亡。

3 病理剖检变化

送检病猪剖检后，可见肺脏有肉变区，表面有出血点，颌下淋巴结肿大，腹股沟淋巴结肿大出血，小肠肠管膨大、充满黄色内容物，肠系膜淋巴结索状肿大(中插彩版图1)，脾脏肿大、切面外翻(中插彩版图2)，肾脏针尖状出血点。

4 实验室检测

4.1 病毒的PCR/RT-PCR检测 圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性引物，由本实验室赵攀登博士惠赠，其序列分别为 PCV-2-F 5′-CACGGATATTGTAGTCCTGGT-3′，PCV-2-R 5′-CGCACCTTCGGATA-TACTGTC-3′，扩增片段大小为494 bp；PRRSV-F 5′-ATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′，PRRSV-R 5′-TCGCCCT-AATTGAATAGGTG -3′，扩增片段大小为434 bp。采集送检仔猪肺脏、淋巴结等病料，加入一定量灭菌PBS研磨，冻融1～2次，离心取上清，按照 HiPure Universal DNA Kit提取试剂盒或者HiPure Viral RNA Kit试剂盒说明书要求提取病毒DNA或RNA，根据2× PCRTaqMaster Mix with dye(Abm公司产品)、TaKaRa One Step RNA PCR Kit(TaKaRa公司产品)要求,进行圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR/PT-PCR特异性片段扩增。

结果显示，待检样品分别扩增出494 bp、434 bp的条带，与圆环病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性对照的扩增条带大小结果一致，去离子水作为阴性对照未扩增出条带(图3)，表明病料中圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒检测结果均为阳性。

图3 圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR结果1：DNA marker； 2：阴性对照； 3：圆环病毒阳性对照； 4：待检样品； 5：阴性对照； 6：猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性对照； 7：待检样品

4.2 细菌的分离培养、染色镜检 无菌采集心脏血液，稀释划线接种于巧克力琼脂平板，37 ℃ 培养24 h， 均生长出一种圆形、半透明、凸起、大小均匀一致的1～2 mm菌落，外观比较纯，没有杂菌生长。挑取单菌落，接种于麦康凯琼脂平板，进一步纯化2～3代， 生长为无色至浅橙色，透明或半透明，圆形，边缘整齐，湿润菌落。革兰染色、镜检可见革兰阴性菌、中等大小、无芽孢的短杆菌(中插彩版图4)，疑似沙门菌。

4.3 分离细菌的PCR鉴定 挑取单菌落，接种于营养肉汤中，37 ℃过夜培养，水煮法提取细菌DNA模板。PCR扩增参照文献[6]进行，上游引物Sal1:5′-CAGGATACCTATAGTGCTGC-3′，下游引物Sal2：5′-CGCACCGTCAAAGGAACCGT-3′。PCR反应体系：PCR Master Mix 10 μL,上游引物 0.5 μL,下游引物 0.5 μL，灭菌的超纯水 8 μL，模板 1 μL。扩增程序：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性 30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，35 个循环；72 ℃ 延伸 10 min，PCR扩增产物进行1%琼脂凝胶电泳分析。结果显示，分离菌扩增条带与预期条带(580 bp左右)一致，去离子水作为阴性对照未见扩增条带(图5)，表明分离菌株为沙门菌。

4.4 药敏试验 选取15种药物，以大肠埃希菌 (ATCC25922)为质控菌株，采用K-B纸片琼脂扩散法，对该分离菌株进行药敏试验。从麦康凯平板上挑取纯化的单个菌落，接种于营养肉汤中，37 ℃过夜培养，比浊法将菌液浓度调为0.5麦氏浓度，用灭菌过的棉签蘸取菌液，均匀涂抹于MH琼脂平板，贴上药敏片，在37 ℃恒温箱培养18～24 h，测定抑菌圈直径。

药敏试验结果表明，该分离菌株对氨苄西林、红霉素、四环素、氯霉素均耐药，对环丙沙星、庆大霉素、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、多黏菌素B、阿米卡星、头孢他啶等药物敏感，对阿莫西林-克拉维酸、头孢唑啉、卡那霉素中介，如表1所示。

表1 药敏试验结果

5 讨论

根据该猪场发病仔猪的临床表现、病理变化以及实验室检测结果，同时妊娠母猪表现为发烧、嗜睡、流产等症状，最终确诊为仔猪沙门菌、猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒的混合感染。本次发病的症状和病变，也可能怀疑为猪瘟，为此，笔者对送检的仔猪病料还进行了猪瘟病毒的RT-PCR检测，结果为猪瘟病毒阴性。

为进一步对发病母猪进行确诊，笔者采用IDEXX公司生产的PRRSV ELISA检测试剂盒，对送检的7头发病母猪的血清进行了猪繁殖与呼吸综合征抗体检测，显示共有5头病猪为猪繁殖与呼吸综合征抗体阳性，结合临床症状表现，表明本次母猪发病很可能为猪繁殖与呼吸综合征病毒感染所导致，因为猪繁殖与呼吸综合征病毒具有抗体依赖增强作用。

该猪场接种了猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒疫苗，并未接种猪繁殖与呼吸综合征病毒和圆环病毒疫苗，猪群缺乏抗病能力，是引起本次发病的根本原因。由于猪繁殖与呼吸综合征病毒和圆环病毒感染均无特效药物治疗，可使用一些中药，如黄芪多糖、板蓝根、大青叶等对症治疗，同时使用抗菌药物控制继发感染，对病猪或带菌猪的排泄物及污染的饲料、饮水、用具、食槽和圈舍等,要用2%～4%火碱溶液或10%～20%石灰乳进行彻底消毒。

仔猪副伤寒是由沙门菌引起，主要危害1～4月龄仔猪，长途运输、天气突变、饲料更换、阴雨天气等因素可以诱发本病。本次病例仔猪的发病，可能是由于在断奶应激因素的作用下，加上猪繁殖与呼吸综合征病毒、圆环病毒混合感染，诱发沙门菌感染所导致。药敏试验结果表明，分离菌株对环丙沙星、庆大霉素等药物敏感，可作为治疗药物使用，但是对四环素、氨苄西林或者氯霉素均耐药，不能作为治疗药物，氯霉素属于禁用药物，作为同一类药物的氟苯尼考可能也具耐药性，因此也不能选为治疗药物。