犊牛腹泻沙门菌抗菌药敏感性试验与中药体外抑菌试验

刘勃兴 ， 赵安奇 ， 柳翠翠 ， 康圆圆 ， 马金换 ， 高桂生 ， 吴同垒 ， 史秋梅 ， 张志强

(河北科技师范学院 河北省预防兽医学重点实验室 ， 河北 秦皇岛 066004)

腹泻病是犊牛养殖过程中的常见疾病，导致犊牛腹泻原因有许多，其中，沙门菌是该病的重要病原[1]。牛沙门菌病又称牛副伤寒，7～28日龄犊牛易发病，主要临床症状为发热、腹泻脱水、关节肿大等，严重时可引起败血症而死亡，是致犊牛腹泻主要细菌病原之一。目前，临床治疗沙门菌所致犊牛腹泻病以抗生素类为主，但随着在临床治疗以及养殖过程中抗菌药物的不合理应用，细菌耐药问题日益严重，给细菌病的防治造成困难。因此，迫切需要筛选出有效的抗菌药物指导临床用药。

中药是我国的传统药材，多属于天然药物，部分中药具有抗菌、消炎、滋补、提高免疫力等作用，并且价格低廉，不易产生耐性，毒副作用低，并有研究表明，中药可以消除耐药质粒，对细菌耐药具有逆转作用，降低细菌的选择压力[2-6]。因此，研发中药作为抗菌药物的替代药具有重要的现实意义。

本试验对13株致犊牛腹泻的沙门菌对抗菌药物和中药的敏感性进行检测，为临床治疗该病用药提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与药品 中药：黄连、蒲公英、桔梗、板蓝根、石榴皮、知母、紫花地丁、白头翁、秦皮、乌梅、苏木、诃子、肉豆蔻、连翘、金银花、五倍子、女贞子、鱼腥草、黄柏、柴胡、五味子、黄芩，均购自秦皇岛唐人医药药店。药敏纸片，购自杭州天和微生物科技股份有限公司。96孔细菌培养板，购自美国Corning公司。2%的氯化三苯四氮唑，购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 菌株 河北地区犊牛腹泻沙门菌地方流行株(NS1～NS13)，由河北预防兽医重点实验室提供。

1.3 菌液制备 将冻存的犊牛腹泻沙门菌接种于LB琼脂培养基，置于37 ℃恒温培养箱培养12 h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，置于37 ℃恒温摇床培养过夜，次日以1∶100的比例转接，于37 ℃摇床培养至对数期(OD600 nm≈0.6)，调整菌液浓度至1×106CFU/mL后备用。

1.4 沙门菌的抗菌药物敏感性试验 采取K-B纸片法，参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)药物敏感性试验方法检测13株沙门菌对氨苄西林、头孢曲松、阿莫西林等15种抗菌药物敏感性。试验结果按照CLSI标准进行判定。

1.5 中药药液制备 采用传统的水煎煮法制备中药药液。称量100 g中药，加入5～10倍量的蒸馏水浸泡1 h，浸泡后大火加热至煮沸，文火煎煮0.5 h，共煎煮2次。将煎煮的药液合并，用纱布过滤后离心，浓缩药液至100 mL即含生药浓度1 g/mL，高压后分装，置于4 ℃冰箱备用。

1.6 中药的体外抑菌直径的测定 参考文献[7-8]，采用琼脂打孔法测定中药对13株沙门菌的体外抑菌直径。每个LB平板加入100 μL 1.3中制备的菌液并涂匀，待平板吸收完全后用直径为6 mm打孔器打孔，用酒精灯封底，每孔灌满1.5中制备的中药提取液(约0.1 mL)，对照孔加入灭菌后的PBS。置于37 ℃恒温培养箱培养12 h，测量抑菌圈直径，试验重复3次，取3次抑菌圈直径的平均值作为最终结果。判定标准：极敏(抑菌圈直径≥20 mm),高敏(20 mm>抑菌圈直径≥15 mm),中敏(15 mm>抑菌圈直径≥10 mm),低敏或耐药(抑菌圈直径<10 mm)。

1.7 中药的最小抑菌浓度(MIC)测定 参考文献[7，9]，采用改良微量二倍稀释平板法测定中药的MIC。在96孔细菌培养板的第2～11孔加入100 μL灭菌蒸馏水，第2孔加入100 μL 1.5中制备的中药提取液，混匀后取100 μL倍比稀释至第9孔后弃100 μL，第2～11孔补加100 μL 2×LB液体培养基，在第2～10孔加入10 μL 1.3中制备的菌液，第10孔为阳性对照组，不加入中药液，第11孔为阴性对照组，不加入菌液。置于37 ℃恒温培养箱培养24 h。判定结果时，在培养板中加入5 μL 2%的氯化三苯四氮唑(TTC)，置于37 ℃恒温培养箱2 h，以不显红的最高稀释孔的中药浓度为MIC。

1.8 中药的最小杀菌浓度(MBC)测定 分别取1.7中96孔培养板培养后的液体50 μL，涂布于LB平板上，置于37 ℃恒温培养箱培养12 h。以无细菌生长的中药浓度为MBC。

2 结果

2.1 沙门菌的抗菌药物敏感性试验 抗菌药物敏感性试验结果显示(表1)，13株分离菌对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧嘧啶、复方新诺明高度耐药，耐药率高达100%，其他11种抗菌药耐药率在30.77%～92.31%。13株沙门菌对阿米卡星的敏感率最高，敏感率为69.23%。13株沙门菌分别对7～15种抗菌药耐药，菌株NS8、NS11对试验的15种抗菌药全部耐药(图1)。试验结果表明，13株犊牛腹泻沙门菌具有多重耐药性，并对检测15种抗菌药均表现出不同程度的耐药。

图1 13株分离菌对15种抗菌药的耐药数Fig.1 The resistance of 13 isolates to 15 antibacterial drugs

表1 13株沙门菌对抗菌药物敏感性试验结果Table 1 Antimicrobial susceptibility test results of 13 Salmonella strains

2.2 中药的体外抑菌直径测定 试验结果显示(图2)，13株沙门菌对8种中药表现出不同程度的敏感性，分别为五倍子、五味子、乌梅、诃子、女贞子、石榴皮、苏木、黄芩。黄连、蒲公英、桔梗、板蓝根、知母、紫花地丁、白头翁、秦皮、肉豆蔻、连翘、金银花、鱼腥草、黄柏、柴胡、五味子15种中药对试验的沙门菌表现为无抑菌效果。中药的体外抑菌直径测定试验结果表明，五倍子对13株沙门菌抑菌作用最强，五味子、乌梅、诃子、女贞子、石榴皮、苏木、黄芩对沙门菌具有一定的抑菌作用，且不同菌株对同种中药表现出的敏感程度不同。

图2 13株沙门菌对8味中药的体外抑菌敏感程度Fig.2 In vitro antimicrobial sensitivity of 13 Salmonella strains to 8 traditional Chinese medicines

2.3 中药的最小抑菌浓度(MIC)测定 中药MIC测定结果显示(表2)，石榴皮对13株沙门菌的MIC为31.25～250.00 mg/mL，石榴皮对13株沙门菌的MIC为7.81～62.50 mg/mL，苏木对13株沙门菌的MIC为62.50～250.00 mg/mL，诃子对13株沙门菌的MIC为15.63～31.25 mg/mL，五倍子对13株沙门菌的MIC为7.81～31.25 mg/mL，女贞子对13株沙门菌的MIC为31.25～250.00 mg/mL，五味子对13株沙门菌的MIC为7.81～62.50 mg/mL，黄芩对13株沙门菌的MIC为125.00～250.00 mg/mL，其余中药对试验的沙门菌均表现无抑菌效果。

2.4 中药的最小杀菌浓度(MBC)测定 中药MBC测定结果显示(表2)，石榴皮对13株沙门菌的MBC为62.50～125.00 mg/mL，乌梅对13株沙门菌的MBC为7.81～62.50 mg/mL，苏木对13株沙门菌的MBC为125.00～250.00 mg/mL，诃子对13株沙门菌的MBC为15.63～62.50 mg/mL，五倍子对13株沙门菌的MBC为7.81～31.25 mg/mL，女贞子对13株沙门菌的MBC为31.25～250.00 mg/mL，五味子对13株沙门菌的MBC为7.81～31.25 mg/mL，黄芩对13株沙门菌的MBC为125.00～250.00 mg/mL，其余中药对13株沙门菌表现为无抑菌效果。综合抑菌直径测定试验、MIC和MBC测定试验，22种单味中药中只有8种中药对13株沙门菌具有抑菌效果，抑菌强度从强到弱依次为五倍子、五味子、乌梅、诃子、女贞子、石榴皮、苏木、黄芩，并且MIC与MBC数值存在一定的差别。

表2 13株沙门菌对8味中药的MIC和MBC测定结果Table 2 MIC and MBC test results of 8 traditional Chinese medicines by 13 Salmonella strains (mg/mL)

3 讨论

沙门菌是人兽共患病菌，对人类与畜禽健康造成严重的威胁[10]。在畜牧生产中，沙门菌感染幼龄动物可引起腹泻、败血症等，造成较高的淘汰率；感染成年动物后经常无临床症状，但感染动物长期带菌，成为感染源，并且该菌可垂直传播，给畜禽养殖造成严重的经济损失[11-13]。沙门菌的防治依靠抗生素类药物，但在畜牧养殖过程中，经常会出现抗生素药物滥用现象，这加速了细菌耐药性的产生。有研究报道，从犊牛分离的细菌多重耐药情况十分严重[14]。根据当地防治情况，本试验对从河北地区分离的13株致犊牛腹泻沙门菌对抗菌药物和中药的敏感性进行了研究。

在本试验中，13株沙门菌均具有多重耐药性，耐药数从7～15种不等，且不同菌株之间的耐药情况不同。检测的15种抗菌药中，13株沙门菌对替米考星、土霉素、磺胺间甲氧嘧啶和复方新诺明耐药率高达100%，表明在河北地区犊牛腹泻沙门菌对这4种抗菌药物的耐药性较高，不推荐临床继续使用这4种药物。13株沙门菌对阿米卡星的敏感率最高，但仍有个别菌株对阿米卡星表现耐药，临床应用时应注意合理用药。据喻华英等[15]报道，其分离出牛腹泻沙门菌对庆大霉素、卡那霉素、头孢噻肟敏感度较高，和本试验中的结果不同，这可能与地区和牛群饲养和治疗用药等方面有关。

致犊牛沙门菌对抗菌药的耐药性较高，为解决该问题，中药作为抗菌药的替代药成为热点研究对象。本试验采取临床上较为常用的水煎煮法提取中药，检测13株沙门菌对22味中药提取液的敏感性。22种单味中药只有8种中药对13株沙门菌具有抑菌效果，抑菌强度从强到弱依次为五倍子、五味子、乌梅、诃子、女贞子、石榴皮、苏木、黄芩。据吴美云[16]报道，乌梅、黄芩、黄连和大黄对奶牛肠道沙门菌有抑菌效果，其中乌梅的抑菌效果最佳；吕信[17]报道的“犊泄康”能有效的防治犊牛腹泻，“犊泻康”由黄连、黄柏、白头翁、乌梅、诃子等13味中药组成。在本试验中，乌梅、诃子、黄芩、诃子的水煎煮提取液同样对13株沙门菌具有抑菌效果，但白头翁、黄连、大黄无抑菌效果，这可能与提取方法、菌株来源不同有关。据李东等[18]报道，五倍子对猪霍乱沙门菌具有良好的抑菌效果；陈虹[19]报道，五倍子对猪伤寒沙门菌和猪霍乱沙门菌具有较好的抑菌效果，在本试验中，五倍子对犊牛腹泻沙门菌的抑菌效果同样最佳，与李东等和陈虹的试验结果相同，表明五倍子对动物肠道沙门菌具有较好的抑菌效果，可以作为沙门菌病的治疗药物进行研究。

通过对13株犊牛腹泻沙门菌对抗菌药以及中药敏感性研究发现，13株沙门菌对抗菌药耐药情况较为严重，而部分中药对沙门菌具有良好的体外抑菌效果，为临床应用抗菌药和中药治疗沙门菌所致犊牛腹泻病提供科学依据。