新疆阿勒泰地区马梨形虫病流行病学调查

瞿业宏 ， 岳 城

(新疆农业大学动物医学学院 ， 新疆 乌鲁木齐 830052)

马梨形虫病(Equine piroplasmosis)是寄生于马属动物的淋巴细胞和红细胞内的血液原虫病。该病主要发生于热带和亚热带地区，在欧洲、非洲、亚洲等地均有发生[1]，我国甘肃、青海、新疆等是该病的高发地区[2]。病原分为马泰勒虫(Theileriaequi,T.equi)和驽巴贝斯虫(Babesiacaballi,B.caballi)。马泰勒虫病的病原为马泰勒虫(旧名马巴贝斯虫)，其虫体小于红细胞半径，呈圆形、逗点形等多种形态。该虫体侵袭动物后破坏红细胞，多表现为稽留热、呼吸困难、贫血、黄疸等症状，如诊治不及时，死亡率极高[3-5]。马驽巴贝斯虫病的病原为驽巴贝斯虫，该病原由媒介蜱虫(革蜱等)携带，携带有病原的蜱虫叮咬后，驽巴贝斯虫随蜱虫唾液进入马属动物血液内，对马属动物造成严重的危害[6-7]，病畜多呈现贫血、消瘦、黄疸、流产等，严重时造成死亡[8]。

本试验对新疆阿勒泰地区的富蕴县、福海县、哈巴河县、清河县4个地区随机抽取放牧马匹进行梨形虫病的检测，以了解该地区的疾病感染率，为今后的综合防控提供部分参考数据。

1 材料与方法

1.1 样品来源 2 697份放牧马抗凝血样品，于2018—2019年采自新疆阿勒泰地区富蕴县(756份)、福海县(831份)、哈巴河县(513份)、清河县(597份)4个地区，每份采集5 mL的血液样品至EDTA抗凝管，标注采集地点与采集时间，-20 ℃保存。

1.2 DNA提取 取马全血200 μL，用DNA提取试剂盒进行全血DNA提取，-20 ℃保存，备用。

1.3 试剂与试剂盒 DNA marker，购自 TaKaRa 公司；2×EasyTaqPCR SuperMix，购自北京全式金生物技术有限公司；DNA提取试剂盒，购自天根生化科技有限公司。

1.4 PCR引物的设计与合成 根据文献[9-10]中马泰勒虫18S rRNA 基因序列与驽巴贝斯虫BC48基因序列设计引物。PCR扩增体系：马泰勒虫：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃ 10 min；马驽巴贝斯虫：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 产物的回收及序列测定 将PCR扩增结果为阳性的产物进行基因目的片段纯化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，利用BLAST在线软件进行同源性分析。

2 结果

2.1 马泰勒虫18S rRNA 基因及马驽巴贝斯虫BC48 基因的PCR检测 共采集到2 697份马匹血液，分别进行马泰勒虫及马驽巴贝斯虫引物扩增后，共有246份马血DNA扩增出马泰勒虫目的片段，约531 bp，大小符合预测值(图1)；经测序比对，确认为马泰勒虫。共有271份马血DNA扩增出马驽巴贝斯虫目的片段，约452 bp(图2)；经测序比对，确认为马驽巴贝斯虫。

图1 马泰勒虫PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of T. equiM：DNA marker 2 000； 1：阴性对照； 2：阳性对照； 3～9：样品的PCR产物M：DNA marker 2 000； 1：Negative control； 2：Positive control； 3-9：PCR product of the sample

图2 马驽巴贝斯虫PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of B. caballiM：DNA marker 2 000； 1～8：样品的PCR产物； 9：阳性对照； 10：阴性对照M：DNA marker 2 000； 1-8：PCR product of the sample； 9：Positive control； 10：Negative control

2.2 马泰勒虫18S rRNA及马驽巴贝斯虫BC48基因序列分析 本试验通过对结果进行马泰勒虫18S rRNA 及马驽巴贝斯虫BC48基因序列测序，BLAST进行相似性检索，分别与马泰勒虫18S rRNA(531 bp)及马驽巴贝斯虫BC48(452 bp)基因序列(GenBank登录号分别为：LC431546.1、MN629354.1)的核苷酸一致性为99%、99%，为所需目的片段。

2.3 马梨形虫感染情况分析 阿勒泰地区共计采集马血2 697份，感染马梨形虫病样品为504份，总感染率为18.69%；马泰勒虫感染246份，阳性率为9.12%，马驽巴贝斯虫感染271份，感染率为10.05%，其中，混合感染13份。哈巴河县感染率最高，为30.80%；其他地区分别为富蕴县17.86%、福海县11.6%、清河县19.10%。经SPSS 20.0分析，各地间马梨形虫感染率差异显著(P<0.05)，见表1。

表1 马梨形虫病感染情况调查Table 1 Investigation on the infection of equine piroplasmosis

2.4 不同年龄段马感染梨形虫病感染情况分析 通过分析不同年龄段感染马梨形虫病的结果显示，马泰勒虫的感染数据中，X≥6年龄组感染率较高，为10.26%(90/877)，而马驽巴贝斯虫在2≤X<6年龄组感染率较高，为11.45%(105/917)，混合感染中，X<2 年龄组感染率最高，为0.66%(6/903)。各年龄组的总感染率分别为X<2年龄组15.50%(140/903)、2≤X< 6年龄组20.72%(190/917)、X≥6 年龄组19.84%(174/877)。经SPSS 20.0分析，不同年龄段马梨形虫感染率差异显著(P<0.05)，见表2。

表2 不同年龄段马梨形虫病感染情况调查Table 2 Investigation on the infection of equine piroplasmosis at different age stages

2.5 不同放牧季节马梨形虫病感染情况分析 通过分析不同季节感染马梨形虫病的结果显示，马泰勒虫的春季与秋季感染分别为11.97%(191/1 595)、4.99%(55/1 102)，马驽巴贝斯虫的春季与秋季感染分别为13.73%(219/1 595)、4.72%(52/1 102)，春秋季总感染率分别为25.20%(402/1 595)、9.26%(102/1 102)，春季感染明显高于秋季感染。经SPSS 20.0分析，不同放牧季节马梨形虫感染率差异显著(P<0.05)，见表3。

表3 不同放牧季节马梨形虫病感染情况调查Table 3 Investigation on the infection of equine piroplasmosis in different grazing seasons

3 讨论

近年来，马梨形虫病的发病率不断上升，严重阻碍了各地马产业的发展。目前，常规的诊断技术主要包括临床诊断和血涂片染色镜检、ELISA、LAMP及PCR等，不同方法的应用可随当地条件、样品的采集等灵活改变[11-13]。其中，PCR方法具有高敏感性和强特异性，尤其适用一些临床症状不明显的隐性感染病例。因此，本次调查采用PCR方法对阿勒泰4个地区的放牧马进行检测，以期对该地区感染有初步的了解，为今后的防治工作提供一定的参考。

马梨形虫病各地区的发病略有不同，马驽巴贝斯虫的感染区域涵盖了欧洲、南非及中东大陆地区的许多国家，在我国的感染率中吉林省为3.79%～42.4%，广州市为5.4%，而新疆感染率为2.2%～38.7%[7，14-15]。有部分人认为马泰勒虫的分布比驽巴贝斯虫更为广泛[16]。调查显示，感染率不等，吉林省为12.50%、延边市为26.09%、哈尔滨市为64.62%，新疆为8.33%～36.21%[17-18]。在本试验中，通过对阳性样品测序分析，经BLAST比对，所测样品为驽巴贝斯虫及马泰勒虫感染。试验得出马梨形虫病感染率为18.69%；其中，马泰勒虫感染率为9.12%，马驽巴贝斯虫感染率为10.05%，混合感染率为0.48%。不同年龄段马梨形虫感染情况差异显著(P<0.05)，不同放牧季节马梨形虫感染率差异显著(P<0.05)，春季感染明显高于秋季感染。该病的传播和流行具有显著的季节性，可能和当地媒介蜱类的分布密切相关；阿勒泰地区地貌类型复杂多样，草场丰富，使得当地马匹受到蜱虫的侵害，尤其是春季温度上升，蜱虫活动频繁，导致春季病情高发。所以，预防该病的重点是灭蜱，从根源上阻止梨形虫病的传播。