儿童急性淋巴细胞白血病抑癌基因ID4甲基化状态及其与疾病进展的关系

赵丽丽 丁显春 向金峰 张 娴 牛文忠

白血病是由于基因组发生变化而导致的造血干/祖细胞疾病，主要特征为大量异常造血细胞恶性增殖、凋亡减少、分化受阻，正常血细胞明显减少等[1-2]。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是小儿白血病中最常见的类型，多发病于小儿，属于造血干细胞异常而导致的克隆性疾病，其特点是高度异质性、分化差异性大[3]。目前AML的发病原因和机理尚未完全明确，临床上只有部分患儿能够通过传统细胞形态学分型法得以准确分型，为此很难判断病情与预测预后[4]。DNA结合抑制因子4(inhibitor DNA binding 4，ID4)属于显性负相螺旋-环-螺旋转录因子亚家族，能激活下游与细胞分化增殖等有关的基因转录[5]。ID4在正常人骨髓中为完全非甲基化状态，但是在血液肿瘤患者中可呈现甲基化状态。ID4编码基因位于6p22-21号染色体上[6]，主要表达于大脑、甲状腺组织中。ID4基因启动子最核心的部位在-48到+32，位于TATA盒下游[7]。此部位包含了sp3基序、E-box盒、sp1基序，其中sp1和sp3是负性调控元件，E-box盒是正性调控作用。ID4基因启动子区富含CpG岛，ID4基因启动子区甲基化与多种肿瘤的发生、发展有关[8-9]。甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation-specific polymerase chain reaction，MS-PCR)是一种测定CpG岛CpG甲基化的重要方法，当前在临床上的应用比较广泛。本研究采用MS-PCR方法，探讨了儿童ALL抑癌基因ID4甲基化状态及其与疾病进展的关系，并探索了ID4甲基化状态对ALL预后的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2017年1月到2020年1月选择在本院诊治的ALL患儿80例作为研究对象，纳入标准：符合AML的诊断标准；年龄2～12岁；临床资料完整，能够配合完成本次研究者；本院伦理委员会批准了此次研究。排除标准：有智力或精神障碍不能配合者；合并其他恶性肿瘤者；严重心、肝、肾等功能障碍者；临床资料缺乏者。根据病情程度分为慢性期32例，加速期28例，急变期20例。不同分期患儿的性别、年龄、体重、身高、T/B分型等对比差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同病情程度分期患儿的一般资料对比

1.2 ID4甲基化检测

取所有患儿的外周静脉血，提取基因组DNA，溶于水中-20 ℃保存。采用MS-PCR进行错增，ID4甲基化上游引物：5′-TTTTATAAGGGCAGCTTGTTGGC-3′下游引物：5′-GAACCGATCCGGGATCTCACTC-3′；ID4非甲基化上游引物：5′-GTTTTATCCGGATTTACGGTTTG-3′下游引物：5′-AAATACCGGTCAATCGACCC-3′。扩增片段长度为155 bp，MS-PCR反应体系包括Master Mix 12.5 μl、上下游引物各2 μl、模板DNA 2 μl，补双蒸馏水至25 μl。扩增反应步骤：94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35个循环。扩增后进行凝胶电泳，在紫外灯下进行观察，PCR产物进行纯化后送上海英骏生物技术有限公司测序。

完全甲基化：仅有155 bp甲基化引物扩增产物条带的标本判定；完全非甲基化：只有156 bp非MS-PCR扩增产物的为ID4基因；部分甲基化：表达以上2种扩增产物。ID4基因完全和部分甲基化的患者均定为甲基化。

1.3 预后随访

所有患儿随访到2020年7月1日，记录患儿的总生存时间与无事件生存时间。

1.4 统计学分析

采用SPSS for windows version20.00统计软件包进行分析处理，计量数据用均数±标准差描述(对比为t检验与方差分析等)，计数数据(对比为卡方检验与方差分析等)，相关性分析采用Spearman相关分析与多因素logistic回归方法，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 ID4甲基化率对比

慢性期、加速期、急变期患儿的ID4甲基化率分别为3.1%(1/32)、46.4%(13/28)和90.0%(18/20)，对比差异都有统计学意义(F=42.348，P<0.05)。

2.2 预后情况对比

80例患儿总生存时间平均为(18.29±1.22)个月，无事件生存时间平均为(10.48±1.78)个月，其中慢性期、加速期、急变期患儿的总生存时间、无事件生存时间对比差异都有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同病情程度患儿的总生存时间、无事件生存时间对比月)

2.3 相关性分析

在80例患儿中，Spearman相关分析显示ID4甲基化率与病情程度、总生存时间、无事件生存时间都存在相关性(P<0.05)。见表3。

表3 ALL患儿抑癌基因ID4甲基化率与疾病进展的相关性(n=80)

2.4 影响因素分析

在80例患儿中，多因素logistic回归方法显示ID4甲基化率、病情程度都为影响患儿总生存时间、无事件生存时间的主要影响因素(P<0.05)。见表4。

表4 影响ALL患儿预后的多因素分析(n=80)

3 讨论

ALL作为一类高度异质性的血液系统恶性肿瘤，在临床上主要表现为骨髓髓系增生、脾脏肿大、外周血白细胞增多等[10]。ALL的治疗原则是缓解患者病情、降低死亡率，主要治疗方法为化疗与放疗；但是由于各种因素的影响，很多患者对化疗与放疗都有一定的耐受性，从而导致治疗失败。ALL可分为慢性期、加速期及急变期，慢性期症状表现无特异性；而进展期常表现为脏器浸润；急变期预后较差，可危及患者生命，为此加强早期诊断与干预具有重要的价值[11]。

现代研究表明ALL的发生是细胞遗传调控及表观遗传调控的紊乱所引起，其中表观遗传可以在不改变遗传信息的前提下引发细胞遗传性改变[12]。基因启动子区DNA甲基化就是重要的表观遗传调控内容，其可引起基因表达沉默，从而下调抑癌基因表达，导致ALL的发生。ID4基因位于46p22-21号染色体上，既能发挥抑癌的作用，又能发挥致癌的作用，可参与细胞周期调控过程，对肿瘤细胞生长、分化、凋亡发挥作用。ID4基因启动子区富含CpG岛，ID4启动子区甲基化是ID4基因表达的主要负性因子。本研究显示慢性期、加速期、急变期患儿的ID4甲基化率分别为3.1%、46.4%和90.0%，对比差异都有统计学意义(P<0.05)，表明随着病情的恶化，ALL儿童的ID4甲基化率逐渐升高。当前也有研究表明ID4基因启动子区在正常人骨髓中呈完全非甲基化状态，而在ALL患者中则出现高达80%以上的甲基化[13]。

随着分子生物学、细胞生物学、表观遗传学的快速发展，早期诊断ALL与预测预后成为可能。有学者回顾性研究发现，<6岁的ALL患儿完全缓解率在50%左右，3年生存率不超过20%[14]。ID4蛋白属于螺旋环螺旋家族成员之一，具有促进细胞增殖、抑制细胞分化等作用。ID4基因的启动子区高甲基化可导致ID4的表达沉默，并使其抑癌作用消失，从而导致白血病的发生。也有研究表明恶性肿瘤ID4基因可频繁发生甲基化，而没有发生突变，提示ID4基因甲基化可导致ID4基因功能丧失，可能是恶性肿瘤发生、发展的重要原因[15]。本研究显示在80例患儿中，总生存时间为(18.29±1.22)个月，无事件生存时间为(10.48±1.78)个月，慢性期、加速期、急变期患儿的总生存时间、无事件生存时间对比差异都有统计学意义(P<0.05)，表明病情程度与患儿的预后显著相关。

ID4又称为分化抑制因子，其作为HLH家族成员的ID分子，需要与bHLH结合成异二聚体后，才能抑制bHLH与DNA及其他组织特异性bHLH转录因子结合，从而参与细胞周期调控过程[16]。ID4基因启动子区甲基化是ID4基因表达的主要负性因素，ID4启动子区甲基化与ID4 mRNA、蛋白表达缺失密切相关[17]。本研究Spearman相关分析显示ALL患儿的ID4甲基化率与病情程度、总生存时间、无事件生存时间都存在相关性(P<0.05)；多因素logistic回归方法显示ID4甲基化率、病情程度都为影响患儿总生存时间、无事件生存时间的主要影响因素(P<0.05)。从机制上分析，当ID4基因启动子区CpG 甲基化异常升高时，可造成ID4基因沉默发生，从而促进白血病细胞的增殖，导致疾病恶化，促进患儿死亡[18-19]。本研究也存在一定的不足，表现为病例数较少且没有对ID4基因其他区域进行甲基化分析，这将在后续研究中加大样本深入探讨。

总之，随着病情的进展，ALL患儿的ID4甲基化率逐渐升高，且与患儿预后生存时间相关，ID4甲基化可作为ALL患儿预后评估的新的指标。