CDKN2A基因突变对肺癌的影响及与预后的关系

程 霞 牛民强 王 宁 刘会敏 黑君芳

随着空气质量的恶化，肺癌的发病率呈逐年上升趋势，已成为我国发病率最高的癌症[1]。肺癌患者常表现为咳嗽、胸痛、气喘等症状，易与肺结核等肺部良性疾病混淆，早期诊断较为困难，因此，寻求一种有效的早期诊断方式对肺癌的治疗至关重要。CDKN2A基因也称多重肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor 1，MTS1)，能够调控细胞生长、增殖过程。有报道指出，CDKN2A基因有可能成为肺癌分子靶向治疗的新方向，这表示CDKN2A基因的表达与肺癌的发生发展过程有关[2]，但目前对于其与肺癌发展及预后的关系尚有争议。因此，本研究通过分析肺癌患者CDKN2A基因表达情况，旨在研究CDKN2A基因在肺癌组织中表达及其诊断和预后价值，为肺癌的早期诊断及治疗提供依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2015年1月至2016年6月在我院治疗的肺癌患者63例，均符合《肺癌影像诊断与临床新进展》关于肺癌的诊断标准[3]，且经病理学检查确诊为肺癌者，并且在术前未进行放化疗治疗者。男性38例，女性25例；年龄42～75岁，平均(56.39±8.05)岁；组织学分型：腺癌20例、鳞癌16例、腺鳞癌15例、小细胞肺癌12例。排除：严重心肝肾功能异常者；肺部良性疾病患者；其他原发性恶性肿瘤患者；预期存活期≤3个月者；放弃治疗者。

1.2 方法

收集肺癌患者手术前癌变组织及癌旁组织(距肿瘤5 cm处，经快速病理诊断为正常组织)样本，提取总RNA，应用北京厚生博泰科技有限公司RT-PCR试剂盒进行扩增，基因序列见表1。总反应体系为25 μl(RNA模版4 μl+上下游引物各2 μl+2*Tap PCRMasterMix 12 μl+双蒸水)，在95 ℃下预处理5 min，并在热变性温度95 ℃下处理30 s，在延伸温度72 ℃下处理30 s，然后延伸10 min(60 ℃、61 ℃、59 ℃，30个循环)，最后采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，根据第二代测序原理分析基因检测结果[4]。

表1 基因序列

1.3 随访情况

采用电话随访或门诊复诊的方式对患者生存情况进行随访，随访时间为术后3年或截止至死亡时间，第1年每3个月随访1次，后两年每6个月随访1次。

1.4 统计学处理

研究所得数据均用SPSS 17软件处理，计数资料采用χ2检验比较组间差异；计量资料经用t检验比较组间差异；采用ROC曲线分析CDKN2A基因对肺癌的诊断价值；采用COX回归分析影响肺癌预后的独立危险因素；采用Log-rank检验对生存曲线进行比较。P<0.05即差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌患者癌组织和癌旁组织CDKN2A基因突变率比较

癌组织中CDKN2A基因突变率为38.09%(24/63)，高于癌旁组织的7.94%(5/63)(χ2=16.170，P=0.000)。

2.2 肺癌组织CDKN2A基因表达与临床病理特征的关系

CDKN2A基因突变型患者和野生型患者在年龄、性别、肿瘤大小、病理类型、分化程度等方面对比无明显差异(P>0.05)；CDKN2A基因突变型患者复发率为45.83%，高于CDKN2A基因野生型患者的17.95%(P<0.05)，见表2。

表2 肺癌组织CDKN2A基因表达与临床病理特征的关系/例

2.3 CDKN2A基因突变诊断肺癌的ROC曲线分析

经ROC曲线分析得，CDKN2A基因突变诊断肺癌的AUC为0.817(95%CI：0.739～0.881；P<0.05)，灵敏度为65.08%，特异度为98.41%，见图1。

图1 CDKN2A基因突变诊断肺癌的ROC曲线

2.4 肺癌组织CDKN2A基因表达与预后的关系

CDKN2A基因突变型患者3年生存率为45.83%(11/24)，CDKN2A基因野生型患者3年生存率为74.36%(29/39)，差异有统计学意义(χ2=5.488，P=0.019)，见图2。

图2 肺癌组织CDKN2A基因表达与预后的生存曲线

2.5 影响肺癌患者术后生存期的独立危险因素COX回归分析

经Logisitic回归分析发现，淋巴结转移、肺癌分期高、肿瘤大小≥3 cm、CDKN2A基因突变为影响肺癌患者术后生存期的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

表3 影响肺癌患者术后生存期的独立危险因素COX回归分析

3 讨论

有报道指出，肿瘤的发生是因为正常细胞内基因发生了突变或失活[5]。有研究指出，在肺癌、乳腺癌、骨肿瘤及皮肤癌等恶性肿瘤中发现CDKN2A基因纯合子缺失，其异常表达可能与肿瘤发生发展过程有关[6-7]。CDKN2A基因是一种新抗癌基因，能够参与细胞周期的调控，抑制细胞增殖和分裂，而肿瘤细胞增殖速度较正常细胞快，这可能是因为肿瘤细胞CDKN2A基因突变或失活，从而使其增殖分化速度增加。本研究中，癌组织中CDKN2A基因突变率高于癌旁组织，这表明CDKN2A基因突变可能与肿瘤发生过程有关，但本研究检测肺癌患者癌组织CDKN2A基因突变率38.09%，略高于林振中等[8]研究，这可能与本研究样本量少及CDKN2A基因阳性表达的检测方法不同有关。

目前国内外有报道指出，CDKN2A基因表达水平与肺癌的发生过程有关[9-11]。CDKN2A基因是一种抑制细胞过度生长、繁殖从而遏制肿瘤形成的负调节基因，它与调控生长的原癌基因协调表达以维持细胞正常生长、增殖和分化，CDKN2A基因突变不仅会丧失其原有的抑癌作用，还会促进细胞过度增殖，甚至导致肿瘤的发生。闫洪生等[12]研究也指出，CDKN2A基因的突变或失活与肿瘤的发生发展过程。CDKN2A基因位于人第9号染色体短臂上，其发生突变时外显子编码的蛋白质可直接调控细胞的增殖与分化，导致癌细胞的产生及恶化。王玉等[13]研究证实了，CDKN2A基因的失活与突变参与了肺癌的发生、发展过程，这提示可通过检测CDKN2A基因的突变情况来诊断肺癌。本研究经ROC曲线分析，CDKN2A基因突变诊断肺癌的AUC为0.706，说明CDKN2A基因突变对肺癌具有诊断价值。

正常细胞分裂周期的完成关键，主要是G1期至S期的顺利转化。有研究指出，CDKN2A基因通过对一系列关键底物磷酸化作用来调节细胞周期，并且可抑制Cdk4活性，阻止细胞进入S期，一旦CDKN2A基因缺失、突变导致正常功能缺失，则不能抑制CDK4，最终导致细胞进入恶性增殖，加速肿瘤发生[14-15]。CDKN2A基因可通过编码蛋白调控细胞生成的特异基因转录，其基因缺失时会使其不再抑制原癌基因，促进肿瘤细胞的增殖、分化，从而增大肿瘤体积，促使癌细胞恶化或转移，不利于患者预后。本研究经Logisitic回归分析得，CDKN2A基因突变型患者复发率为41.67%，高于野生型患者的20.51%(P<0.05)；CDKN2A基因突变是影响肺癌患者术后生存期的独立危险因素；CDKN2A基因突变型患者3年生存率低于野生型患者，说明CDKN2A基因突变型患者预后较差，与林振中等[16]研究结果相同。这表示可通过检测肺癌患者CDKN2A基因表达来预测预后情况。另外本研究发现，淋巴结转移为影响肺癌预后的独立危险因素，说明淋巴结转移的肺癌患者预后较差，与殷航等[17]研究结果相同，这可能是因为淋巴结遍布全身，淋巴结转移意味着癌细胞会顺着淋巴循环到达各组织器官，加重患者病情，降低治疗效果，不利于预后。

综上所述，肺癌患者癌组织CDKN2A基因突变率高于癌旁组织，CDKN2A基因突变对肺癌具有预测价值，且为影响肺癌患者术后生存期的独立危险因素，因此可通过检测CDKN2A基因突变情况来初步判断患者是否患有肺癌及预测患者预后。