冬凌草甲素通过上调p53抑制三阴性乳腺癌细胞增殖并诱导凋亡的机制

刘 晖 赵春英 郑 洁 王 凤 杨华锋 王建东

三阴性乳腺癌是一种具有高度侵袭性的乳腺癌，患者常表现出耐药性，靶向治疗效果不佳[1]。冬凌草甲素是香茶菜属植物中含量较高双萜类生物碱，具有明确的抗肿瘤功效[2]，但对于其抑制乳腺癌细胞的作用和机制尚未有深入研究。本研究着重考察冬凌草甲素对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-468的抗癌活性，并从细胞增殖和凋亡角度，探索冬凌草甲素抑制乳腺癌细胞的作用机制，为其在临床的进一步应用提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 细胞与抗体

DMEM培养基(Thermo Fisher，lot No.2024699)；FBS(GIBCO，No.10091148)；冬凌草甲素(曼斯特，No.MUST-17041120)；DMSO(Life science，No.0236C042)；青霉素(Life science，No.1842944)，链霉素(GIBCO，No.1846496)。MDA-MB-468人乳腺癌细胞购自浙江如耀生物科技有限公司。抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 MTT法

采用MTT比色法检测乳腺癌细胞增殖活性。将细胞制成单细胞悬液接种于96孔培养板，培养24 h后加入不同浓度冬凌草甲素(1.25、2.5、5、10、20、40 μM，以加等量不含药培养基为对照组)，孵育48 h后，每孔加入15 μl MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h后弃上清，加入150 μl DMSO，振荡10 min。以560 nm为检测波长，630 nm为参比波长，测定吸光值，并以不加药的培养基孵育48 h作为空白对照，计算冬凌草甲素对乳腺癌细胞的抑制率。

1.3 DAPI染色

MDA-MB-468细胞爬片，冬凌草甲素干预24 h，预冷70%乙醇固定，加入DAPI染液(1 μg/ml)染色2～3 min，去掉染料后PBS漂洗一次，荧光显微镜下观察细胞核形态特征。

1.4 细胞凋亡

采用Annexin-FITC流式检测试剂盒检测细胞凋亡水平。将MDA-MB-468细胞加冬凌草甲素处理24 h后，调节细胞浓度至1×106/ml。吸取100 μl的细胞悬液，加入400 μl结合缓冲液，加5 μl Annexin V/FITC和10 μl 20 μg/ml的碘化丙啶溶液，混匀后室温避光孵育15 min，进行流式检测。

1.5 Western-blot分析

收集阴性对照组及冬凌草甲素处理24 h后的MDA-MB-468细胞，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解5 min，12 000 rpm/min离心10 min后取上清，加入5×上样缓冲液，于100 ℃变性5 min。蛋白经10% SDS-PAGE电泳分离后，转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，加入一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，使用ECL显色试剂盒进行显影。以GAPDH为内参，Image J分析条带灰度值，计算蛋白相对含量。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 冬凌草甲素对乳腺癌细胞增殖的影响

冬凌草甲素分别作用24 h和48 h后，进行MTT测试。结果显示，冬凌草甲素对MDA-MB-468细胞有明显抑制，冬凌草甲素10 μM作用48 h后抑制率可达到(97.24±6.21)%，随后提高浓度其抑制率不再增加(图1)。因此，后续选择10 μM为冬凌草甲素作用浓度用于研究。

图1 冬凌草甲素对乳腺癌细胞的抑制趋势

2.2 冬凌草甲素对乳腺癌细胞形态的影响

冬凌草甲素处理后的MDA-MB-468细胞数量随着作用浓度增加而明显减少，在10 μM时，大量细胞变圆，从培养皿中脱离。随后，根据DAPI染色结果，发现未加冬凌草甲素的空白对照组细胞核较完整，未见明显凋亡形态。冬凌草甲素处理后，高倍镜下可见部分细胞呈典型凋亡形态，表明冬凌草甲素可诱导细胞凋亡，且随着浓度的增加，凋亡的细胞增多。

2.3 冬凌草甲素对乳腺癌细胞周期的影响

冬凌草甲素干预后，MDA-MB-468细胞周期结果如图2所示，G2/M期细胞比例均有明显增加，且与冬凌草甲素浓度成正相关，对照组中G2/M期比例为(14.07±4.01)%，而冬凌草甲素作用浓度达到10 μM时，MDA-MB-468的G2/M比例增加至(26.26±2.61)%；同时S期和G0/G1期的细胞比例降低，呈现一定的剂量依赖性，表明冬凌草甲素可将细胞周期阻滞在G2/M期。

2.4 冬凌草甲素对乳腺癌细胞凋亡的影响

将冬凌草甲素处理24 h后的MDA-MB-468细胞进行Annexin V/PI双染色，结果显示，早期凋亡(Q1-LR区域)和晚期凋亡(Q1-UR区域)细胞比例均随冬凌草甲素作用的浓度增加而逐渐提高，体现在UR和LR区域细胞比例的逐渐提高，说明冬凌草甲素能够诱导细胞凋亡，并呈现剂量依赖性。见图3。

图3 冬凌草甲素对乳腺癌细胞凋亡的影响

2.5 冬凌草甲素对增殖和凋亡有关蛋白的影响

MDA-MB-468细胞经冬凌草甲素处理，免疫印迹分析表明，p53表达随着冬凌草甲素作用浓度的增加而提高，PARP总蛋白水平在10 μM时下调，其活化形式随浓度增加而上调。细胞凋亡相关蛋白包括cleaved Caspase-3(Caspase-3活化形式)、cleaved Caspase-9(Caspase-9活化形式)以及Cyt.C(细胞色素c)随着作用浓度的增加而上升。随着冬凌草甲素浓度增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的水平随之下调，诱导凋亡蛋白Bax则有增加的趋势。见图4。以上结果进一步提示，冬凌草甲素可通过启动内源和外源性途径诱导乳腺癌细胞凋亡。

图4 免疫印迹结果

3 讨论

冬凌草甲素已被证实具有广泛的抗肿瘤效果[3]。研究发现，冬凌草甲素对胃癌细胞[4]、结直肠癌细胞[5]，白血病细胞[6]等都有一定的抑制作用。在研究冬凌草甲素抗肿瘤机制时发现，它还可以通过增加细胞周期相关蛋白的磷酸化来激活细胞周期检查点，从而影响细胞周期进程，进一步发挥对肿瘤细胞的抑制作用[7-8]。在非小细胞肺癌的研究中发现，冬凌草甲素可促进SPC-A-1细胞中Bax表达，而抑制Bcl-2的表达，从而促进肺癌细胞凋亡[9]。在胰腺癌的研究中发现类似结果，冬凌草甲素不仅改变Bax/Bcl-2的表达，而且可促进细胞色素c从线粒体的释放，从而触发线粒体凋亡途径[10]。

目前尚无针对三阴性乳腺癌的专用药物，临床上采用阿霉素等抗癌药在一定程度上抑制乳腺癌的发展，但是存在较大副作用。而冬凌草甲素可能通过促凋亡和抗血管生成作用协同增强阿霉素对侵袭性乳腺癌的抗肿瘤作用，从而降低阿霉素带来的副作用[11]。也有报道冬凌草甲素可以联合卡培他滨显著提高对MDA-MB-231人乳腺癌细胞的抑制率[12]。本研究的MTT测试结果显示，冬凌草甲素能显著抑制乳腺癌细胞的增殖。DAPI染色直观显示了冬凌草甲素可以抑制乳腺癌细胞的增殖。细胞周期及细胞凋亡实验结果则显示冬凌草甲素可将细胞阻滞于G2/M期，这与先前在乳腺癌细胞MCF-7中观察到的结果一致[13]。

为进一步探讨冬凌草甲素抑制乳腺癌细胞增殖的机制，本文还对细胞增殖和凋亡途径相关蛋白表达量进行检测。细胞凋亡途径可初略分为内源性和外源性途径，最终都通过Caspase-3活化启动凋亡进程，外源性途径以Caspase-9的活化等为代表，而内源性途径则以线粒体膜上Cyt.c的释放为代表。p53是调节细胞存活和凋亡的关键蛋白，已有研究证明p53可同时诱导内源性和外源性凋亡的发生[14]。p53上调以后意味着细胞损伤后的监控增强，有DNA损伤的细胞无法进入复制周期，继而走向凋亡。三阴性乳腺癌患者中约有80%以上存在p53突变，近年也有发现部分化合物可重新激活突变型p53，将其恢复为野生型构象，且在乳腺癌临床前模型中均表现出活性[15]。本研究发现，冬凌草甲素作用于MDA-MB-468细胞后，p53表达量上调，说明冬凌草甲素能增加抑癌蛋白表达，促进细胞周期阻滞，从而抑制细胞增殖。同时，研究还发现在冬凌草甲素的干预下，乳腺癌细胞凋亡相关蛋白Caspase-3，Caspase-9和PARP被活化，Cyt.c的表达增加。在本研究中显示，冬凌草甲素可同时启动内源性和外源性凋亡途径诱导细胞死亡。由此可以推断，冬凌草甲素不仅抑制细胞增殖，而且可诱导乳腺癌细胞的凋亡，其主要机制可能在于上调p53的水平。总之，冬凌草甲素可能通过上调p53水平，导致细胞监控加强，错误细胞无法进入复制周期，最终导致细胞凋亡。

综上所述，冬凌草甲素能够有效抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-468的增殖，阻滞细胞周期，促进乳腺癌细胞凋亡，且其作用效果在一定范围内呈现出剂量依赖性。其初步作用机理为通过上调p53表达，活化细胞凋亡途径关键蛋白Caspase 3、Caspase-9 和PARP。后期我们将考虑进一步的体内研究以明确其对三阴性乳腺癌的抑制效果。