RASSF1A启动子甲基化和蛋白表达在涎腺腺样囊性癌中的临床意义

岳万远 张 莉 刘 华 张莉萍

涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤，约占所有涎腺恶性肿瘤的22%。它具有某些独特的生理特征，如生长缓慢，但无包膜，侵袭性较强，极易侵袭神经和血管，发生嗜神经生长和远处转移，其中肺是最常见的远处转移部位，患者的长期生存率极低[1-3]。对于涎腺肿瘤的治疗，目前仍以手术为主，但术后常出现复发、转移[4]。近年来，随着人们对表观遗传学认识和研究的深入，肿瘤发生、发展的表观遗传学机制成为肿瘤研究的热点[4]。据报道，表观遗传机制，如启动子甲基化，在肿瘤抑制基因转录失活中发挥重要作用。RAS关联域家族蛋白1A(RASSF1A)是人类恶性肿瘤中最常见的表观遗传学灭活肿瘤抑制基因之一。启动子甲基化是RASSF1A基因失活的主要机制，在许多人类实体瘤中已得到证实[2]。RASSF1A启动子甲基化的频率在肿瘤中可达99%，而在正常组织中则为0[5-6]。因此RASSF1A甲基化状态作为一种有吸引力的癌症风险和预后的生物标志物，具有强大的临床应用潜力。目前为止，鲜少有关于SACC患者中RASSF1A启动子甲基化的报道。因此，本研究通过对60例SACC患者进行研究，旨在检测RASSF1A启动子甲基化和蛋白表达水平，并探讨其作为预后和生存指标的可能性，为临床精准治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 临床组织样本

60例SACC组织和60例正常涎腺组织样本均来自我院2014年2月至2018年12月收治的经病理诊断确认为涎腺癌的患者。所有组织样本手术后暂存于液氮中，24 h后存于-80℃冰箱备用。患者在手术前，没有其他治疗史，本研究所有参与对象均已签署知情同意书，且经过我院伦理委员会的审核同意。所有组织样品均用福尔马林固定，石蜡包埋；组织切片(4 mm)用苏木精和伊红染色。所有患者的病理染色结果由3名病理医师复查确诊。

1.2 主要试剂与材料

电泳转模装置(美国Bio-Rad公司)；PVDF膜、凝胶成像系统(IS 1000)(美国Pharmacia Biotech公司)；MSP分析仪(德国Roche Applied Science公司)；RNA PCR试剂盒(中国宝生物工程有限公司)；羊抗RASSF1A抗体(美国R&D Systems公司)；辣根过氧化物酶标记二抗(中国联科生物技术有限公司)；SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(中国碧云天生物技术研究所)；亚硫酸氢钠修饰试剂盒(德国QIAGEN公司)。本研究用到的甲基化和非甲基化序列由日本TaKara公司合成。

1.3 甲基化特异性PCR(MSP)分析RASSF1A启动子甲基化

从石蜡切片中提取DNA，使用亚硫酸氢钠对DNA进行修饰。RASSF1A引物序列如下：F：GTGTTAACGCGTTGCGTATC；R：AACCCCGCGAACTAAAAACGA。根据制造商的说明，PCR扩增与HotStar Taq DNA聚合酶(Qiagen)的反应量为12.5 ml，阴性对照组用水替代DNA。以正常淋巴细胞提取的DNA作为阳性对照。用SssI酶(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)处理。扩增反应程序如下：95℃ 2 min，1 个循环；95℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s，2个循环；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃，10 min。最后PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭染色，紫外灯照射下直接观察。

1.4 Western Blot检测RASSF1A蛋白表达

从石蜡组织切片中提取蛋白，并用BCA蛋白检测试剂盒对蛋白浓度进行定量。蛋白质样品用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)分离，转移到PVDF膜上，加入封闭液室温摇床封闭 2 h，加入一抗RASSF1A (1：3000)孵育1 h，转置4 ℃ 摇床孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗，孵育1 h。洗膜后，将PVDF膜滴加适量的 ECL 发光液并迅速放入凝胶成像仪中成像分析，β-actin被用作内参。

1.5 qRT-PCR检测RASSF1A甲基化mRNA表达

使用Trizol试剂从SACC肿瘤组织切片中提取总RNA，根据cDNA合成试剂盒说明书将mRNA逆转录为cDNA。用SYBR-PrimeScript-RT-qPCR试剂盒进行实时定量PCR(qRT-PCR)检测RASSF1A启动子甲基化后的mRNA表达量，以GAPDH作为内参对照。RASSF1A甲基化引物序列为：F：GCTCGTCTGCCTGGACTGTT；R：GGGCATTGTACTCCT TGATCTT。扩增条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s；57 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s；30个循环后，72 ℃ 10 min。相对表达水平用2-△△Ct法计算。

1.6 统计分析

实验结果用统计软件SPSS 20.0分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。RASSF1A基因甲基化、蛋白表达水平与患者临床病理特征之间的相关性分析采用χ2检验。GraphPad Prism 7绘制数据结果图。P<0.05或P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RASSF1A启动子甲基化水平在组织中的表达情况

我们对60例SACC肿瘤组织和60例正常涎腺组织进行了MSP检测，结果如图1所示：在60例SACC肿瘤组织切片中，12例组织的RASSF1A启动子未被检测到甲基化；48例组织中检测到RASSF1A启动子甲基化的表达，其中13例组织启动子部分甲基化，35例组织启动子呈高甲基化状态。但在60例正常涎腺组织中，未检测到RASSF1A启动子甲基化的表达。

M为甲基化引物扩增结果；U为非甲基化引物扩增结果。

2.2 RASSF1A mRNA的表达水平

基于MSP的检测结果，我们对60例SACC肿瘤组织样本和60例癌旁正常涎腺组织样本中RASSF1A mRNA的表达进行检测，结果显示，与正常涎腺组织相比，RASSF1A 基因的mRNA在涎腺癌组织中的表达显著降低(图2A、B，P<0.01)。进一步检测发现，在RASSF1A mRNA的表达降低与涎腺癌组织中RASSF1A基因启动子的甲基化相关。具体来讲，在60例涎腺癌组织中，RASSF1A基因启动子无甲基化的涎腺癌组织(12例)、RASSF1A基因启动子部分甲基化的涎腺癌组织(13例)、RASSF1A基因启动子高甲基化的涎腺癌组织(35例)中RASSF1A mRNA的相对表达依次降低(图3A、B，P<0.01)。这些结果提示RASSF1A基因高甲基化可能是该基因表达下调的原因之一。

A为RASSF1mRNA在涎腺腺样囊性癌(SACC)患者癌组织和癌旁组织的表达；B为癌组织中不同启动子甲基化程度样本中RASSF1mRNA的相对水平。

2.3 RASSF1A蛋白在组织中的表达情况

Western blot分析结果显示，RASSF1A蛋白在SACC肿瘤组织中的表达明显低于癌旁正常涎腺组织(图4，P<0.01)。该结果与RASSF1A mRNA在涎腺癌组织中的表达趋势相一致。这提示RASSF1A基因启动子的甲基化不仅导致RASSF1A mRNA在涎腺癌组织中的表达降低，并且也导致RASSF1A蛋白在涎腺癌中的表达下调。

图4 Western blot检测RASSF1A蛋白在SACC肿瘤患者癌旁组织和癌组织中的表达

2.4 RASSF1A基因甲基化、蛋白表达与SACC患者临床病理指标之间的相关性

根据RASSF1A蛋白在患者癌组织中的相对表达水平的平均值，我们将60例SACC患者分为高表达组(23例)和低表达组(37例)。如表1所示，RASSF1A蛋白在SACC患者癌组织中的相对表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小等无关，差异无统计学意义(P>0.05)；而与患者TNM分期、淋巴结转移明显相关，差异均有统计学意义(P<0.05)。根据RASSF1A基因启动子有无甲基化，我们将60例SACC患者分为甲基化组(48例)和无甲基化组(12例)；如表1所示，RASSF1A蛋白在SACC患者癌组织中的甲基化与患者的年龄、性别、肿瘤大小等无关，差异无统计学意义(P>0.05)；而与患者TNM分期、淋巴结转移明显相关，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 RASSF1A基因甲基化、蛋白表达与患者临床病理指标之间的关系/例

2.5 RASSF1A蛋白表达、基因启动子甲基化水平与患者生存的关系

我们采用Westernblot的检测结果，以RASSF1A相对表达水平(相对于正常组织)的中位数为界限将患者分为RASSF1A高表达和低表达2组；对60例患者进行定期随访。根据随访结果，用log-rank检验进行结果分析，绘制Kaplan-meier's生存分析图(图5)。其中RASSF1A蛋白高表达的SACC患者在相同时间内的生存率显著高于低表达患者(图5A，P<0.01)。以RASSF1A启动子有无甲基化将将患者分为甲基化和无甲基化2组；与12例无甲基化的患者相比，48例RASSF1A启动子甲基化的SACC患者生存率显著降低(图5B，P<0.01)。这些结果表明，RASSF1A蛋白表达降低和基因启动子甲基化与SACC患者的生存率降低密切相关，是导致患者预后不良的一个重要因素。

图5 RASSF1A蛋白表达水平和启动子甲基化与患者的生存分析

3 讨论

SACC是颌面外科最常见的高度恶性肿瘤，浸润性极强，易侵入血管，随血运转移，除此之外，还易沿神经扩散[7]，转移和复发是导致患者死亡的主要原因[8-9]。然而目前对该肿瘤的转移和复发的具体机制仍缺乏了解[4]。

研究表明，SACC的发生发展是一个多基因、多步骤的过程，而其分子学基础是癌基因的激活和/或抑癌基因的失活。RASSF1A已被证实是一个抑癌基因，在细胞周期控制、微管稳定、细胞粘附、运动和凋亡等方面发挥作用[2,10]。同时研究表明，DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖和分化等方面扮演重要的角色，并与肿瘤的发生发展关系密切[11-14]。启动子甲基化是一种表观遗传变化，是RASSF1A基因失活的主要机制，已在包括人类非小细胞肺癌[15-17]、乳腺癌和结直肠癌的实体肿瘤中得到证实[18-19]。因此，RASSF1A启动子甲基化可能是此类肿瘤的预后指标。

在本研究中，我们用MSP方法检测了60名SACC患者的组织样本和正常涎腺组织样本的RASSF1A启动子甲基化表达水平，结果显示，在60例SACC肿瘤组织切片中，有48例检测到RASSF1A启动子甲基化，但在正常涎腺组织中未检测到，这与先前的报道结果一致[5-6]。正常涎腺组织中未检测到RASSF1A启动子甲基化，而SACC肿瘤组织中检测出高频率的RASSF1A启动子甲基化水平，这表明RASSF1A的不同表达状态与SACC肿瘤发生有关。同时，我们用Western blot检测了SACC肿瘤组织和正常涎腺组织中RASSF1A蛋白的表达情况。结果显示，与正常涎腺组织相比，SACC患者组织中RASSF1A蛋白表达显著降低。该结果提示RASSF1A基因甲基化是导致RASSF1A蛋白表达下调的原因之一。这与先前研究报道的RASSF1A在小肠类癌中的甲基化，并在初步研究中观察到RASSF1A表达的缺失与甲基化之间有较高的一致性的结果一致[20]。

由于SACC生长比较缓慢，容易侵袭周围的神经及血管，向周围扩散，部分患者能够带瘤生存，但预后欠佳[21]。本研究结果显示，SACC患者的临床分期、淋巴结转移被认为是预后较差的预测因素。这与文献报道的Ⅲ、Ⅳ期患者比Ⅰ、Ⅱ期患者预后效果差，提示分期越高则预后越差结果一致[22]。除此之外，RASSF1A基因启动子甲基化也被报道在手术治疗的非小细胞肺癌[2,15]、乳腺癌[23-24]、Ⅰ期和Ⅱ期肺癌[25]和Wilms肿瘤[2,26]中导致较差的生存率。因此，我们对48例RASSF1A启动子甲基化的SACC肿瘤组织进行qRT-PCR检测。结果显示，有35例SACC肿瘤组织中RASSF1A的mRNA表达水平较高，13例SACC肿瘤组织中RASSF1A的mRNA表达水平较低。同时对其进行Western blot检测，结果与qRT-PCR结果一致，35例SACC肿瘤组织中RASSF1A蛋白表达水平较高，13例SACC肿瘤组织中RASSF1A蛋白表达水平较低。这一结果表明，基因甲基化与实体肿瘤模式相关；RASSF1A基因可能在SACC的发生进展中尤为重要。在膀胱癌[2,27]和Wilms肿瘤[2，26]中也有类似的结论。我们的研究结果为RASSF1A启动子甲基化作为在SACC患者预后和生存生物标志物的潜在有效性提供了证据。

综上所述，本研究表明，RASSF1A基因启动子甲基化在SACC癌变过程中发挥了重要作用，可能是患者生存和预后的生物标志物。同时研究显示，RASSF1A的蛋白表达缺失与甲基化之间普遍存在一致性。我们可以通过抑制RASSF1A启动子甲基化，来抑制SACC癌变，从而为SACC患者治疗的新靶点提供理论依据。