有氧跑台训练对小鼠左右心肌特定miRNAs的影响

张海鹏，徐 琳，宋彦霖，徐盛嘉，杨 靖，马继政，钟 勇

0 引 言

合理的体育活动是一种有效的干预措施，可以改善生活质量，并延长预期寿命。目前，广泛认为有氧训练可以诱发独特的心脏保护表型，用来预防和治疗心血管疾病。心血管系统反映出急性和长期运动的明显改变。这些适应变化的核心涉及心血管系统内细胞和分子信号通路变化的协同整合，使组织能够应答运动时人体的需求[1]。心脏肥大是机体对有氧运动主要适应之一，可以正常化室壁应力，减少氧气消耗，并增加工作能力，使其存在明显的机械优势[1]。因此，认识运动性心肌肥大的适应过程，具有重要的生理意义。

当前，微小RNA分子(micro RNAs, miRNAs)已经成为潜在的生物标志物，可响应并参与运动中的适应性变化[2-3]。miRNAs是短的非编码RNA，通过抑制蛋白质翻译或增强信使RNA(mRNA)的降解，调节转录后基因的表达[2-3]。miRNAs参与正常的功能性心脏组织的发育，控制细胞的生长、分化、凋亡和增殖，并参与心血管病理生理变化的调控，例如肥大、纤维化和心肌细胞的损害[2]。

左右心室是相互依存的，嵌套在心包内，具有共同的隔膜，并被共同的心肌纤维包围。研究表明耐力训练后左室中发生的结构和功能适应，可能与右室存在不同。鉴于上述原因，本研究选择肌肉组织高表达的肌组织特异miRNAs(miR-208a、miR-208b和miR-499)[2,3]，以及其他的被认为在心肌中重要的miR-21、miR-17-3p[2-3]，观察长期的有氧练习左右心肌中这些miRNAs的变化，为有氧运动提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物取48只健康C57BL/6J雄性小鼠(8周龄)，购自北京生命实验动物技术有限公司(SPF级)，小鼠置于光照/黑暗周期为12 h，温度为(22±2)℃，湿度为45%～50%的屏障环境中，自由饮食。实验程序经南京大学动物保护和使用委员会批准(IACUC-2006001)。将小鼠按体重随机数字分组划分为对照组和训练组，每组24只。2组在第0周进行跑台预适应及递增负荷测试(incremental load test，ILT)后，运动组进行8周有氧跑台训练，对照组正常饲养不进行跑台训练。动物于下午1点至5点在明亮室内进行跑台训练或运动能力测试。

1.2 测试方法

1.2.1 ILT训练组小鼠使用运动跑台进行训练(型号：ZH-PT，安徽正华)，适应阶段对照组与训练组都以10 m/min的速度运动10 min，跑步机无倾斜角度，持续5 d[4]。48 h后进行ILT测试，测试方案为：小鼠以6 m/min的速度在跑步机上进行运动，每3分钟增加3m/min的速度递增直至小鼠力竭。当小鼠在1 min内触碰跑步机末端5次及以上时，被定义为力竭。力竭速度计算公式为：

EV=V+(n/b)×a

其中V是最后一次完成阶段的速度；n是未完成阶段的保持的持续时间；b是每阶段的持续时间；a是测试递增速度[5]。

1.2.2 有氧训练方案和表现评估本实验中使用的有氧训练方案参照文献[4]进行。期间每周第6天定时记录小鼠的体重变化情况。并在第0周适应性训练、第4周和第8周有氧训练结束后48 h对2组进行ILT测试，对小鼠的运动表现进行评估与记录。

1.3 心肌样本提取于第8周最后一次ILT测试结束48 h后，断颈处死所有小鼠。在无菌无RNA酶的条件下，收集小鼠左、右心室心肌组织置于液氮中速冻，并存于-80°C中后续分析待测。

1.4 RNA的提取使用RNAiso Plus9(型号：9109，Takara)抽提试剂盒，将冷冻的左右心室心肌匀浆进行总RNA的提取。并进行定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)，所有样品都是在一个批次内进行处理的。以探针法为基础进行RT-qPCR，得到相应的cDNA产物。使用TaqMan PCR试剂盒(Thermo Fisher Scientific，美国)和Roche LightCycler©96 (Roche,瑞士)进行qPCR检验。qPCR条件为95℃预孵育5 min，95℃15 s、60℃60 s共 45个循环，最后37℃冷却30 s。使用以下TaqMan©探针进行对应miRNA的检测：snRNA U6 (ID: 001973)、hsa-miR-208a (ID: 000511)、hsa-miR-208b (ID: 002290)、mmu-miR-499 (ID: 001352)、hsa-miR-21 (ID: 000397)和mmu-miR-17-3p (ID: 002543)。所有反应进行3次技术重复。将心肌中miRNAs的相对snRNA U6归一化表达，并使用2-ΔΔCt方法计算Ct值。

2 结 果

2.1 8周有氧训练小鼠体重变化情况整个实验周期间，对照组与训练组在训练后期产生体重变化上的差异，其中对照组于第5周、第6周、第7周和第8周的体重显著高于训练组(P<0.05；P<0.001；P<0.001；P<0.0001)，见图1。8周的跑步机有氧训练方案结束时，对照组小鼠体重变化百分比(16.18±5.14)%与训练组(5.30±6.15)%比较，差异有统计学意义(P<0.0001)，见图2。

*P<0.05、**P<0.001、***P<0.0001

*P<0.0001

2.2 8周有氧训练小鼠ILT测试结果第0周时对照组与训练组的力竭速度差异无统计学意义(P>0.05)；第4周训练后训练组力竭速度[(29.37±3.49)%]显著高于对照组[(20.54±2.21)%，P<0.0001]；第8周时测试结果表明，训练组力竭速度[(35.71±4.53)%]仍显著高于对照组[(21.28±5.47)%，P<0.0001]；见图3。此外，随着有氧训练方案的推行，训练组小鼠的有氧运动能力不断提升，与第0周力竭速度比较，第4周时提升40.79%(P<0.0001)，第8周时提升71.15%(P<0.0001)，第8周较第4周成绩上升21.56%(P<0.0001)。

*P<0.0001

2.3 8周有氧训练心肌组织中miRNAs的变化

2.3.1 左右心肌组织中肌组织特异miRNAs的变化与对照组比较，训练组中左心室心肌miR-208b和miR-499的水平显著下降(P<0.01；P<0.05)，分别改变1.96倍与2.59倍，但在右室心肌中差异无统计学意义(P>0.05)。值得注意的是，miR-208a在小鼠左右心室的心肌中差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

*P<0.05、**P<0.01

2.3.2 左右心肌组织中心肌其他miRNAs的变化与对照组比较，训练组左心室心肌miR-21与miR-17-3p水平显著减少(P<0.05；P<0.05)，分别改变2.53倍和1.13倍。与左心室心肌的显著改变不同的是，miR-21与miR-17-3p在右心室心肌中的水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。有氧训练并不影响这些miRNAs在右心室心肌中的表达。

*P<0.05

3 讨 论

长期有氧训练会导致心脏超负荷，引起结构和功能发生适应变化，被称为“运动员的心脏”。传统上，认为这种心脏重塑的量在左右心腔之间是平衡的。但是，在剧烈运动期间，右心室会承受不成比例的后负荷和室壁应力，长期运动引起的变化可能更为明显。本研究结果显示心肌相关的miR-208b和miR-499水平仅在左心室心肌中下降，而miR-21与miR-17-3p仅在左心室心肌中增加。表明左、右心室心肌重构存在不同。

有氧运动引起的心脏肥大是一种生理反应，涉及对收缩和代谢成分的基因和蛋白质表达的精确编排。miRNAs参与这些生理过程的变化。前期研究发现，miR-208a、miR-208b和miR-499均由肌球蛋白基因编码，因此也被称为“肌相关microRNAs(MyomiRs)”，调节多个mRNA靶标，进而调节心肌肥大和代谢途径[6]。研究表明，游泳训练对miR-208a和miR-208b水平的表达存在抑制作用，会增加Med13、Purβ、Sox6、异染色质蛋白1β(Heterochromatin Protein 1β, HP1β)和特异性蛋白(specificity proteins,Sp)/Kruppel样转录因子3(Kruppel-like transcription factor 3, SP3)蛋白的表达，调节代谢，收缩途径和表观遗传控制，从而调节α-MHC/β-MHC比率并传递信号，诱发生理性的肌肉肥大。但miR-499未发生变化[6]。本研究结果显示，8周有氧跑台训练可影响miR-208b和miR-499水平的变化，进一步表明这些MyomiRs参与调控心脏肥大。其出现差异的原因可能和有氧练习的方式有关[2-3]。另外，研究发现游泳训练可增加miR-21水平[靶向磷脂酶和张力蛋白同源物(phosphataseandtensinhomolog, PTEN)和TSC-2]，可激活心肌细胞PI3K/Akt/mTOR信号途径[7]；增加miR-17-3p的表达，可抑制PTEN(PI3K/Akt拮抗途径)，而PI3K/Akt是参与心肌肥大最重要的一个途径[8]；本研究同样观察到8周跑台训练后左室心肌miR-21和miR-17-3p水平增加，进一步支持体育活动的有益影响。但值得注意的是，在心血管疾病中，miR-21 的表达普遍升高[9]。

但在右心室的心肌中，未观察到这些miRNAs的变化，表明左右心肌重构存在不同。与左心室相比，长期耐力运动右心室的扩大程度有所提高[10]。研究发现长期的有氧运动训练主要是通过增加线粒体产生ATP的能力，增强右心室的代谢重塑[11]。因此，评定代谢相关miRNAs的变化，有助认识右心室的重构现象。运动过程中右心室承受的负荷和室壁压力大于左心室[12]。在健康个体中，右心室具有足够的心力储备，以适应短期高强度运动期间肺动脉压的升高[13]。但是，如果保持高强度运动数小时，则可能会影响右心室功能并导致心肌微损伤，最终导致心脏病理性改变[14]。认识运动性心肌肥大的适应过程，了解运动如何诱导心脏生长可能有助于确定新的治疗靶标，以减轻对病理应激的不良心脏重塑。但这些途径是否可以增强心脏有限的再生能力，从而帮助补偿心肌细胞的损失，仍是未经证实的[15]。