TRIP13通过激活Notch1通路促进肝癌细胞对索拉非尼耐药的机制研究

陶冬英，任典寰，范任华，杨菊林，于纪棉

索拉非尼是美国食品药品监督管理局批准的治疗晚期肝癌的一线靶向药物，能显著提高患者的中位生存时间，但随着治疗时间的延长，许多患者表现出耐药性[1]，目前耐药机制还不是特别清楚。甲状腺激素受体相互作用蛋白13（TRIP13）是AAA+ATP酶超家族中的一员，位于染色体5p15.33，其在有丝分裂过程中纺锤体组装检查点和DNA损伤修复中发挥着重要作用[2]。最近研究发现，TRIP13在肝癌中的表达上调，且过表达TRIP13可促进肝癌的发展进程[3-4]，但是TRIP13与肝癌细胞的索拉非尼耐药的关系目前相关报道未见。本研究拟建立索拉非尼耐药性HepG2细胞株，来探究TRIP13在肝癌细胞索拉非尼耐药中的作用和机制。报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验材料 人肝癌细胞株HepG2购自中科院上海生命科学院细胞所，MEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司，索拉非尼购自美国Sigma公司，TransScript Reverse Transcriptase和2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）为北京全式金生物技术有限公司产品，RIPA裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，TRIP13兔多克隆抗体（1∶1 000）购自美国Thermo Fisher公司；Notch1兔单克隆抗体和Hes1兔单克隆抗体购自美国Cell Signaling technology公司；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，TRIzol试剂和Lipofectamine 2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，MTT试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，TRIP13 siRNA序列和对照序列由上海吉玛公司合成：si-TRIP13序列，5’-GCTGGTAACCAAGATGTTT-3’；si-NC序列，5’-GCTCAATGAACGTAGGTTT-3’。

1.2 索拉非尼耐药性HepG2细胞株的建立 采用浓度递增法对HepG2肝癌细胞进行长时间的培养，建立索拉非尼耐药HepG2细胞株（HepG2-SR）模型。选取HepG2为亲本细胞，使用MEM培养基在37℃、5%CO2条件下培养，待细胞状态稳定后，在培养液中加入1M索拉非尼，培养1周后，换成更高浓度的索拉非尼（每次增加1M），直至细胞能在10M索拉非尼培养液中稳定生长，表明HepG2-SR细胞成功诱导。

1.3 细胞分组和转染 将2×106个HepG2-SR细胞接种到6孔板中，过夜贴壁后，细胞融合度达到60%左右，将细胞分成3组：对照组、si-NC组及si-TRIP13组。后两组细胞按照Lipofectamine 2000试剂盒说明书操作分别将50 nMsi-NC和50 nMsi-TRIP13转染至细胞中，转染6 h后更换培养基。对照组细胞不进行任何处理，37℃、5%CO2条件下继续培养。

1.4 MTT检测 细胞活力使用MTT检测。分别将HepG2和HepG2-SR细胞按照3×103个/孔的密度接种至96孔板里，每孔加入1、5、10或者20M索拉非尼。细胞培养箱中培养48 h后，每孔加入10l MTT溶液，37℃继续孵育4 h，加入100l异丙醇溶解沉淀，最后使用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度值。使用Graphpad Prism 5软件计算索拉菲尼的IC50（即抑制率50%时索拉菲尼的浓度）。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将2×106个HepG2-SR细胞接种到6孔板中，按照上述方式转染50 nM si-TRIP13和50 nM si-NC，转染48 h后，加入10M索拉非尼培养24 h。用适量胰酶消化细胞，1 000 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取1×106个重悬细胞，1000 g离心5min，去除上清后加入195l Annexin V-FIT C结合液、5l Annexin V-FITC和10l碘化丙啶（PI），室温避光孵育15 min后使用流式细胞仪进行检测。

1.6 Real-time PCR检测 细胞中TRIP13、E-cadherin和Vimentin mRNA水平使用real-time PCR方法检测。利用TRIzol试剂提取各处理组中细胞的总RNA。使用oligo（dT）引物将2g总RNA逆转录成cDNA，按照PCR试剂盒说明书操作加入模板和引物，配置25l的反应体系，按照下面条件进行PCR反应94℃5 min；94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，共35个循环；72℃5 min。TRIP13上游引物：5’-GCTTCCCCATCTGGTGCTTT-3’，下游引物：5’-GTGGCTTTCTAGCTTGCAGTC-3’；E-cadherin上游引物：5’-AGGGGTTAAGCACAACAGCA-3’，下游引物：5’-GGTGTATACAGCCTCCCACG-3’；Vimentin上游引物：5’-TCCGCACATTCGAGCAAAGA-3’，下游引物：5’-TGATTCAAGTCTCAGCGGGC-3’；-actin上游引物：5’-TGAGCGCGGCTACAGCTT-3’，下游引物：5’-TCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’。使用-actin作为内参，按照公式2－Ct计算TRIP13、Ecadherin和Vimentin mRNA的表达量。

1.7 Western blot检测 将适量RIPA裂解液加入细胞中，充分裂解后，12 000 g离心15 min。蛋白浓度使用BCA法进行测定。每个样品取40g蛋白，沸水浴变性后上样进行SDS-PAGE电泳。将分离后的蛋白转移至PVDF膜上后，用溶解于TBST缓冲液中的5%脱脂奶粉封闭2 h。然后加一抗4°C过夜孵育，接下来使用TBST缓冲液清洗3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，再加入ECL发光液显色。以-actin为内参，计算TRIP13、Notch1和Hes-1蛋白的相对表达量。

1.8 统计方法 数据采用SPSS20.0软件分析，所有实验最少重复3次，计量数据用均数±标准差表示，多组间比较采用F检验，多重比较采用LSD-t检验；两组间比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TRIP13表达及MTT结果 采用浓度递增法对HepG2肝癌细胞进行长时间培养，建立HepG2-SR细胞模型。MTT检测显示索拉非尼对HepG2和HepG2-SR细胞的IC50分别为4.72M和26.42M（图1A）。HepG2-SR细胞的IC50比HepG2细胞增加了5.6倍，这说明HepG2-SR细胞成功建立。Realtime PCR和westernblot检测TRIP13 mRNA和蛋白水平表达，结果如图1B和1C所示：与HepG2细胞相比，HepG2-SR细胞中TRIP13 mRNA和蛋白水平均显著增加（P＜0.05）。

图1 HepG2-SR细胞中TRIP13表达上调

2.2 HepG2-SR细胞对索拉非尼的敏感性 检测不同处理的HepG2-SR细胞中TRIP13表达，结果显示：与si-NC组相比，si-TRIP13组中TRIP13的表达显著降低（P＜0.05，图2A）。MTT检测各组细胞中的IC50，结果显示：si-NC组和si-TRIP13组中IC50分别为27.30M和8.94M。与si-NC组相比，si-TRIP13组中IC50显著降低（P＜0.05，图2B）。流式细胞术检测细胞凋亡，结果见图2C：与si-NC组相比，si-TRIP13组中凋亡细胞数目明显增多（P＜0.05）。

图2 下调TRIP13可增加HepG2-SR细胞对索拉非尼的敏感性

2.3 HepG2-SR细胞的上皮间质转化 结果如图3所示：与si-NC组相比，si-TRIP13组中E-cadherin mRNA表达显著增加，Vimentin mRNA水平显著降低（P＜0.05）。

图3 下调TRIP13可抑制HepG2-SR细胞的EMT

2.4 生物信息学预测肝癌组织中TRIP13与Notch1的关系 使用Starbase软件分析TRIP13与Notch1基因在374例肝癌组织中的相关性，发现TRIP13表达与Notch1水平在肝癌组织中呈现正相关（r=0.33，P＜0.01）。见图4。

图4 TRIP13与Notch1表达在肝癌组织中的相关性分析

2.5 下调TRIP13可抑制Notch1通路活化 Western blot检测HepG2-SR细胞中Notch1和Hes-1表达，结果如图5所示，与si-NC组相比，si-TRIP13组中Notch1和Hes-1降低（P＜0.05）。

图5 HepG2-SR细胞中下调TRIP13可抑制Notch1通路活化

3 讨论

AAA+ATP酶家族包含53个成员，这个家族的蛋白通过水解ATP产生机械能改变蛋白质和多核苷酸的构象，在蛋白质降解、DNA复制和膜融合事件中发挥作用[5]。越来越多的研究发现，AAA+ATP酶家族蛋白参与了多种肿瘤的发生和进展过程[6]。TRIP13是AAA+ATP酶家族中比较保守的一个成员，在多种肿瘤中其表达明显上调，且表达量与患者的不良预后相关。最近的文献报道显示，TRIP13在肝癌组织中表达升高，高水平的TRIP13与患者较差的预后有关。过表达TRIP13可促进肝癌生长和转移[3]，但是目前国内外还没有文献报道TRIP13与肝癌索拉非尼耐药的关系。

本研究发现，HepG2索拉非尼耐药性细胞株HepG2-SR中TRIP13表达较HepG2亲本细胞高，这表明TRIP13可能参与了肝癌细胞的索拉非尼耐药。使用siRNA技术在HepG2-SR细胞中下调TRIP13，发现下调TRIP13后，索拉非尼对细胞的IC50值降低，细胞凋亡增加。这表明下调TRIP13可增加肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。

研究已经证实EMT不仅在肝癌进程中促进恶性肝癌细胞的扩散，也在包含索拉非尼在内的多种药物耐药中发挥着重要作用，抑制EMT可逆转癌细胞对药物的耐药[7-8]。在多种癌症中都发现TRIP13可以调节EMT进程[3,9]。本研究结果发现，下调TRIP13可抑制HepG2-SR细胞的EMT。这表明TRIP13增加肝癌细胞索拉非尼耐药与其促进EMT有关。Wang等[10]的研究发现Notch1信号在索拉非尼耐药的肝癌细胞中被激活，而且Notch1信号活化能够促进肝癌细胞对索拉非尼耐药。Notch1是调控癌细胞发生EMT的一个重要信号通路[11]。本课题组通过生物信息学的方法分析发现，在肝癌组织中TRIP13与Notch1的表达呈现正相关。这说明在肝癌的索拉非尼耐药中TRIP13可能与Notch1存在着某种联系。Hes-1是Notch1下游一个重要的调控分子，本研究结果显示，下调TRIP13显著降低了Notch1和Hes-1的表达，这表明下调TRIP13可抑制Notch1通路的活化。

综上所述，TRIP13在索拉非尼耐药的肝癌细胞中表达升高，它可增加肝癌细胞对索拉非尼耐药，这可能是通过激活Notch1通路，进而促进肝癌细胞的EMT引起的。TRIP13的水平可能是预测肝癌细胞对索拉非尼反应的一个潜在标志物，联合TRIP13拮抗剂和索拉非尼治疗可能能够增强索拉非尼抗肝癌的治疗效果。