利用二茂铁检测植物油过氧化值方法的建立

姚云平 于淼航 陈丽媛 刘 丹 李昌模，2

(1.天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457；2.桂发祥十八街麻花食品〔天津〕有限公司，天津 300221)

油脂在工业生产以及人们日常生活中应用广泛，油脂的质量与人们的健康息息相关。但是在生产加工以及使用过程中油脂会发生氧化，产生各种氧化产物，这些物质会对油脂的品质以及人们的健康产生不良影响[1]。

过氧化值(POV)是反映油脂新鲜程度和质量的重要指标[2]。碘量滴定法是目前检测油脂过氧化值最常用的方法[3]。但是，碘化钾对氧非常敏感，环境中的氧会影响其检测结果[4]。有试验[5]发现，油脂中的不饱和脂肪酸对碘有吸收作用，会导致检测结果偏低。此外，碘量滴定法还存在操作繁琐，取样量大，试剂使用量大，反应终点不易判断，检测结果容易受到操作者主观影响等问题[6-7]，这些因素都会影响检测结果的准确性。

目前也有一些其他方法用于检测油脂的过氧化值。如：化学发光(CL)法，该方法虽然可以检测到较低浓度的脂质氢过氧化物，但是化学发光的强度却容易受油脂的种类和浓度的影响[8-10]；傅里叶红外光谱法，利用三苯基磷与氢过氧化物的反应可以定量检测各种食用油的过氧化值，但是反应产物与三苯基膦的光谱存在交叉干扰的潜在风险[11-14]；2-硫代巴比妥酸(TBA)法，因其简单和可重复性高且成本低而被广泛应用于油脂、未加工的肉类和鱼类产品等食品基质中[15]，但样品需要经过高温和酸处理，可能存在人为的过氧化反应，影响最终的检测结果[16-17]；亚铁离子氧化法[18-19]，具有简单快速、试剂使用量小、特异性好等优点，但是其吸收系数会受到多种因素的影响，同时线性范围窄，再现性低等问题也限制该方法的应用[20]。

二茂铁是一种过渡金属氧化物，由两个环戊二烯和一个铁原子组成[21-22]，具有可逆的氧化还原特性，常被用作还原剂或者催化剂。较其他检测方法中使用的试剂，二茂铁具有更好的热稳定性和化学稳定性[23-24]。Chen等[25]报道了二茂铁衍生聚合物探针在电化学生物传感中的应用，该研究证明，基于二茂铁聚合物的纳米传感器应检测过氧化氢是可行的。Murgandani等[26]报告了一种灵敏、快速且具有选择性的安培法测量亚油酸和亚麻酸及其氢过氧化物，该方法主要通过氢过氧化物氧化二茂铁而形成阴极电流，通过对电流的测定评价样品的氧化程度，且试验结果不受还原剂和其他过氧化物的干扰。前人的研究证实了二茂铁与氢过氧化物可发生计量反应的可行性。但是直接应用二茂铁来检测油脂的过氧化值还未见报道。

试验拟以二茂铁作为反应试剂，利用二茂铁与油脂中的过氧化物发生的反应，采用化学计量学方法建立过氧化物与二茂铁反应的线性关系，以期开发一种快速、准确、方便的油脂过氧化值的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生油：市售；

异丙醇、甲酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

过氧化氢异丙苯标准品(CHP)：纯度80%，上海麦克林生化科技有限公司；

二茂铁标准品：纯度98%，上海麦克林生化科技有限公司；

紫外—可见光分光光度计：Evolution 300型，赛默飞世尔科技公司；

恒温水浴锅：HH-S型，江苏国胜实验仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 标准液及油样制备

(1)二茂铁标准溶液：准确称取0.54 g二茂铁标准品置于烧杯中，加入适量异丙醇溶解后倒入100 mL容量瓶中，用异丙醇定容，即得浓度为29 mmol/L的二茂铁标准溶液，氮封后放置在4 ℃下备用。

(2)过氧化氢异丙苯溶液：准确称取0.6 g过氧化氢异丙苯标准品(纯度80%)置于10 mL棕色容量瓶中，异丙醇定容，配置成浓度为315.4 mmol/L的过氧化氢异丙苯母液，然后逐级稀释为3.15～44.15 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液，氮封后放置在4 ℃下备用。

(3)油样的制备：准确称取0.4 g食用油置于10 mL容量瓶中，用异丙醇定容，氮封后放置在4 ℃下备用。

1.2.2 最佳吸收波长的确定 分别取15.77，7.89 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液各1 mL于2支干净的试管中，各加入1 mL二茂铁标准溶液和0.1 mL甲酸后用异丙醇定容至5 mL(相当于过氧化氢异丙苯的浓度为3.15，1.58 mmol/L)。在恒温水浴锅中60 ℃下反应40 min，反应结束后立即用流动的水冷却至室温，使用紫外分光光度计在200～600 nm范围内进行全波长扫描，异丙醇作为空白校准基线，通过对比样品吸光度之间的关系，按式(1)计算离散系数，确定最佳吸收波长。

(1)

式中：

Vs——离散系数；

σ——吸光度值的标准差；

μ——吸光度值的平均值。

1.2.3 反应摩尔比的确定 取0.1 mL二茂铁标准溶液和1 mL不同浓度(3.15～44.15 mmol/L)的过氧化氢异丙苯溶液于不同的试管中，加入0.1 mL甲酸后用异丙醇定容至5 mL。在60 ℃的恒温水浴条件下加热40 min，结束后立即用流动水冷却至室温，使用异丙醇校准基线在310 nm处检测吸光度值，通过二茂铁与过氧化氢异丙苯在不同摩尔比时的吸光度确定二者反应的饱和摩尔比。

1.2.4 酸催化剂的选择 试管中加入1 mL二茂铁标准溶液后，加入1 mL 浓度为15.77 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液，然后分别加入0.1 mL有机酸(甲酸，乙酸)和无机酸(硫酸)，异丙醇定容至5 mL。60 ℃的恒温水浴锅中反应40 min，反应完成后在200～600 nm下进行全波长扫描。

1.2.5 温度和时间的影响 选择30，40，50，60，70 ℃ 5组不同的温度。每个样品中分别加入1 mL二茂铁标准溶液和1 mL浓度为15.77 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液，加入0.1 mL甲酸后用异丙醇定容至5 mL，在不同的反应温度下加热40 min，反应后冷却至室温在310 nm处进行检测。设置10，20，30，40，50 min反应时间，同样的反应条件下在310 nm处检测吸光度变化。

1.2.6 过氧化氢异丙苯标准曲线的绘制 取0.1，0.2，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，1.0 mL浓度为15.77 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液于试管中，加入1 mL二茂铁标准溶液和0.1 mL甲酸，异丙醇定容至5 mL，在最佳检测条件下以过氧化氢异丙苯的浓度(x)为横坐标，吸光度值(y)为纵坐标绘制标准曲线。按式(2)计算油脂过氧化值。

(2)

式中：

PV——过氧化值，mmol/kg；

Y——样品的吸光度；

B——空白的吸光度；

A——标准曲线的系数；

M——取样量，g；

V——定容体积，mL。

1.2.7 检出限和定量限 参照文献[27]的方法确定二茂铁法的检出限。在玻璃管中分别加入0.0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL的1.58 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液，再加入1 mL二茂铁标准溶液和0.1 mL 的甲酸，用异丙醇定容至5 mL(相当于样品中过氧化氢异丙苯浓度为0.00，0.03，0.06，0.10，0.13，0.16，0.19，0.22，0.25，0.28，0.32 mmol/L)。在恒温水浴锅中60 ℃加热40 min，加热结束后立即用流动水冷却至室温，在310 nm处检测其吸光度。得到检出限的估计值后按照加标浓度为估计检出限的1～5倍范围确定过氧化氢异丙苯添加量，在干净的试管中加入合适的过氧化氢异丙苯溶液(15.77 mmol/L)，再加入1 mL二茂铁标准溶液和0.1 mL 的甲酸，用异丙醇定容至5 mL，在60 ℃下加热40 min，加热结束后立即用流动水冷却至室温，在310 nm处检测吸光度值，共检测7组平行。根据式(3)求得方法检出限，以方法检出限的3.3倍为定量限。

LD=st(n-1,1-α)，

(3)

式中：

LD——方法检出限，mmol/L；

s——加标样品测试结果的标准偏差；

t——自由度为n-1时的Student's值，可查值表得到，当n=7时，在99%置信区间(α=0.01)下，t=3.14；

n——加标样品数量，一般取7。

1.2.8 回收率 在试管中分别加入1 mL空白油样、低加标油样(3.15 mmol/L过氧化氢异丙苯)、中加标油样(7.89 mmol/L 过氧化氢异丙苯)、高加标油样(12.62 mmol/L过氧化氢异丙苯)，再加入1 mL二茂铁标准溶液和0.1 mL的甲酸，用异丙醇定容至5 mL，在60 ℃条件下加热40 min，然后在310 nm下检测样品的吸光度值。

1.2.9 滴定法测定过氧化值 按GB 5009.227—2016执行。

2 结果与分析

2.1 最佳吸收波长的确定

为了选择最佳检测波长，考察过氧化氢异丙苯浓度为1.58，3.15 mmol/L时与二茂铁反应的全波长(200～600 nm)扫描图，结果如图1所示。

由图1可知，在300～400 nm的范围内随着过氧化氢异丙苯浓度的增加样品吸光度值变大，虽然最大吸收波长在318 nm处，但是通过对比吸光度值离散系数(表1)可知，在310 nm处吸光度值的离散系数最大，即在310 nm处的空白样品的吸光度与标准样品吸光度的差值最大，检测最为灵敏。所以选择310 nm为最佳检测波长。

图1 最佳检测波长的优化

表1 不同波长下吸光度值离散系数

2.2 反应摩尔比的确定

由图2可知，二茂铁与过氧化氢异丙苯反应的饱和摩尔比(n二茂铁∶n过氧化氢异丙苯)为1∶4，说明二茂铁结构中2个环戊二烯可以与4个过氧化物结合或者每个环戊二烯与一个过氧化物结合，其余两个过氧化物与铁形成络合物。为了保证在标准曲线范围内二茂铁过量且吸光度值处于检测器的最佳检测范围，选择二茂铁标准溶液的浓度为29 mmol/L，过氧化氢异丙苯标准溶液的浓度为15.77 mmol/L。

图2 过氧化氢异丙苯与二茂铁反应摩尔比

2.3 酸性催化剂的优化

二茂铁在酸性条件下与氢过氧化物反应，选择硫酸、甲酸、乙酸，分别加入二茂铁溶液以及二茂铁与过氧化氢异丙苯的混合溶液中，并进行全波长扫描。结果发现由甲酸提供的氢离子浓度可使催化反应进行的同时，保证二茂铁不分解，硫酸(强酸)使二茂铁分解而乙酸存在下没有显示反应性，故选择甲酸作为催化剂。

如图3所示，随着甲酸体积分数的增大，二茂铁与过氧化氢异丙苯反应产物在310 nm范围内的吸光度值不断升高，表明酸性催化剂体积分数的升高有助于反应的进行。但是，过低的酸性条件可能会破坏二茂铁与过氧化氢异丙苯反应产物的结构[28]。因此，最终选择体积分数为2%的甲酸，验证实验也表明在该酸性催化剂条件下，过氧化氢异丙苯不会发生分解。

图3 甲酸浓度对吸光度的影响

2.4 温度对反应的影响

由图4可知，二茂铁与过氧化氢异丙苯的反应随温度的提高形成反应产物的含量不断增加，当60 ℃后反应基本达到了平衡，温度再升高其生成物含量变化微弱。考虑到氢过氧化物容易受到高温的影响而发生变化，所以选择60 ℃作为最佳反应温度。

图4 反应温度对样品吸光度的影响

2.5 反应时间的影响

由图5可知，随着加热时间的延长反应产物含量增加，当在60 ℃加热40 min时，二茂铁与过氧化氢异丙苯的反应达到平衡状态，即使增加反应时间反应产物含量恒定。故选择40 min作为最佳反应时间。通过滴定验证过氧化氢异丙苯浓度的方法检验过氧化氢异丙苯在60 ℃ 加热40 min后的稳定性，结果表明在该条件下过氧化氢异丙苯不会发生变化。

图5 反应时间对样品吸光度的影响

2.6 标准曲线的制定

在310 nm处，过氧化氢异丙苯浓度和吸光度值之间的线性回归方程为y=0.175 2x+0.220 2，R2=0.999 6。标准曲线线性方程呈现了良好的线性关系，可以作为过氧化物的定量方法用于检测。浓度为0.00，0.03，0.06，0.10，0.13，0.16，0.19，0.22，0.25，0.28，0.32 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液与二茂铁反应后在310 nm处的吸光度曲线结果如图6所示。曲线在0.126 mmol/L处出现明显拐点，在0.126～0.630 mmol/L的范围内选择空白样品加标浓度为0.473 mmol/L，平行检测7个样品。7个平行样品吸光度值的检测结果为0.376±0.003，根据式(3)得到二茂铁法的检出限为0.08 mmol/L，定量限为0.26 mmol/L。

图6 过氧化氢异丙苯在低浓度处的折点

2.7 添加回收率

称取0.20 g花生油，添加0.1 mL浓度为3.15，7.89，12.62 mmol/L的过氧化氢异丙苯溶液配置成低、中、高加标油样，转换成过氧化物值分别为15.44，39.74，63.10 mmol/kg，称取油样时，每次称取都有些差异导致过氧化物含量发生波动，计算结果如表2所示。

表2 二茂铁法的添加回收率

计算结果表明，二茂铁方法的加标回收率在98.16%～100.03%，二茂铁检测方法与过氧化物含量检测结果具有很好的对应性，完全符合作为检测方法对过氧化物的检测，说明该方法能有效检测油脂中的氢过氧化物含量。

2.8 两种方法对实际样品的检测比较

取4组新鲜的花生油置于烧杯中，分别在120 ℃下加热0，1，3，5 h，加热后的样品分别使用二茂铁法和滴定法进行检测。

以二茂铁法测得过氧化值(mmol/kg)为横坐标(x)，以滴定法测得过氧化值(mmol/kg)为纵坐标(y)，建立线性回归方程。两者的线性回归方程为y=0.883 4x-3.590 3，R2=0.996 7，说明两种方法对实际油样的检测结果具有良好的线性关系，但是也观察到其斜率不为1，由于油脂体系较为复杂，二茂铁可能会与油脂中的其他成分发生反应(含氧自由基、过氧自由基等)，导致检测结果增大，这一现象需要通过进一步的试验去解释，同时也观察到回归方程与y轴不交于零点处，这可能是由于二茂铁法中油脂完全处于有机试剂中，其氧化产物更容易被完全反应，所以其过氧化值较大。

图7 植物油样品两种方法检测结果的比较

3 结论

通过试验，发现油脂中的过氧化物与二茂铁进行反应具有对应关系；将二茂铁方法与国标滴定法进行比较，发现两种方法具有良好的线性关系，且二茂铁法具有试剂性质稳定不受空气和光照影响，取样量少，试剂使用量少，操作过程简单的特点。