一测多评法同时测定钩藤饮片中4种生物碱类化学成分△

范恺磊，王协和，杜俊潮，李松，张云天，陈盛君，*，陈可冀，彭军，许运明

1.江阴天江药业有限公司，江苏 江阴 214434；2.江苏省中药配方颗粒制备与质量控制关键技术重点实验室，江苏 江阴 214434；3.江苏省中药配方颗粒工程技术中心，江苏 江阴 214434；4.江苏省中药配方颗粒工程研究中心，江苏 江阴 214434；5.福建中医药大学 中西医结合研究院，福建 福州 350112

钩藤原名钓藤，始载于《名医别录》，《中华人民共和国药典》2015年版一部规定钩藤来源于茜草科钩藤属植物钩藤Uncariarhynchophylla(Miq.) Miq.ex Havil.、华钩藤U.sinensis(Oliv.) Havil.、大叶钩藤U.macrophyllaWall.、毛钩藤U.hirsutaHavil.和无柄果钩藤U.sessilifrutusRoxb.的带钩茎枝，主要分布于广西、广东、贵州、福建、江西等地[1]。钩藤作为常用中药，具有清热平肝、息风止痉等功效[2]，现代常作为降压药配伍使用[3]，也具有神经保护[4]等功效。生物碱是钩藤中主要活性成分，主要为吲哚生物碱和氧化吲哚生物碱。钩藤中现今已发现的吲哚类生物碱成分有100多种[5]，有效成分为钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱和异去氢钩藤碱等[6-7]。其中钩藤碱占了总生物碱的28.9%，异钩藤碱占了总生物碱的14.7%，两者占了钩藤总碱的40%以上[8]。因此，以钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱4种生物碱作为钩藤质量控制主要指标具有一定合理性，但由于钩藤中生物碱含量低、对照品获得性较难、价格昂贵，不利于对钩藤饮片进行质量控制。因此，本研究基于一测多评(QAMS)测定钩藤中4种生物碱含量，对于钩藤饮片的质量控制具有一定的现实意义。

1 材料

1.1 仪器

UPLC(美国沃特世公司)；UPLC(赛默飞世尔科技有限公司)；1260型HPLC仪(美国安捷伦公司)；KQ-250E型超声清洗机(昆山超声仪器有限公司)；ME204E型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；GKC型控温水浴锅(南通华泰实验仪器有限公司)；Sartoris arium 611 DI型超纯水机(德国赛多利斯公司)；乙腈(色谱纯，ThermoFisher公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

1.2 试药

对照品钩藤碱(批号：112028-201601，纯度≥98%)、异钩藤碱(批号：11927-201403，纯度≥98%)购于中国食品药品检定研究院；对照品去氢钩藤碱(批号：ST10570120MG，纯度≥98.0%)、异去氢钩藤碱(批号：ST11080120MG，纯度≥98.0%)购于上海诗丹德生物技术有限公司。

12批钩藤饮片均为产地调研收集样品，经江阴天江药业有限公司唐波教授鉴定为茜草科植物钩藤的干燥带钩茎枝，其产地信息见表1。

表1 钩藤样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Thermo Accucore C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，5 μm；100 mm×2.1 mm，2.6 μm)；以0.02%三乙胺溶液(2%磷酸调节pH至7.5～7.6)-乙腈(65∶35)为流动相；检测波长为246 nm；柱温为30 ℃；体积流量为0.4 mL·min-1；进样量为1 μL；理论板数按异钩藤碱峰计算应不低于8000。

2.2 混合对照品溶液的制备

取对照品钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱适量，精密称定，加甲醇制成含钩藤碱42.10 mg·mL-1、异钩藤碱39.79 mg·mL-1、去氢钩藤碱39.80 mg·mL-1、异去氢钩藤碱40.92 mg·mL-1的混合溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25 mL，密塞，称定质量，加热回流45 min，取出，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学验证

2.4.1专属性 分别精密吸取2.2项下的混合对照品溶液、2.3项下供试品溶液、阴性对照溶液甲醇，按2.1项下色谱条件进行测定，结果表明，空白溶剂色谱与对照品、供试品色谱相对应保留时间处均没有相应的色谱峰，说明该方法对测定钩藤饮片中的去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱具有专属性，无其他干扰，结果见图1。

注：A.阴性对照溶液；B.混合对照品溶液；C.异去氢钩藤碱对照溶液；D.去氢钩藤碱对照品溶液；E.异钩藤碱对照溶液；F.钩藤碱对照溶液；G.钩藤饮片供试品溶液。图1 钩藤饮片供试品溶液、阴性对照品溶液、4种生物碱类成分对照品溶液及混合对照品溶液的UPLC图

2.4.2线性考察 分别精密量取混合对照品溶液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 μL，注入液相色谱仪，按2.1项下的色谱条件测定，以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)，绘制标准曲线，求得回归方程。结果表明，去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱在相应的线性范围内进样量与峰面积值呈良好的线性关系，结果见表2。

表2 4种生物碱类成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.4.3精密度试验 精密吸取2.2项下混合对照品溶液注入液相色谱仪，按2.1项下色谱条件测定，连续进样6次，记录其峰面积测量值，计算RSD，结果表明，去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱精密度RSD分别为0.16%、0.17%、0.19%、0.32%，说明仪器精密度良好。

2.4.4重复性试验 取钩藤饮片(编号：S3)平行6份，分别按2.3项下供试品溶液制备方法制成供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定，记录异去氢钩藤碱、去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱峰面积值，计算其平均含量及 RSD，结果表明，去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱平均含量RSD分别为0.81%、1.70%、0.69%、1.99%，结果表明该方法重复性良好。

2.4.5稳定性试验 取2.3项下的样品(编号：S3)分别于0、1、2、4、8、12 h进样，进样1 μL，测定峰面积值，计算其RSD，测得去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱峰面积的RSD分别为0.58%、0.79%、1.13%、1.42%，结果表明，所测定的4个生物碱类成分在12 h内稳定性较好。

2.4.6加样回收率试验 取钩藤饮片(编号：S3)粉末约0.25 g，精密称定，分别加入异去氢钩藤碱(93.37 μg·mL-1)、去氢钩藤碱(176.91 μg·mL-1)、异钩藤碱(143.08 μg·mL-1)、钩藤碱(71.16 μg·mL-1)对照品适量，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测得4种成分的加样回收率，结果表明，去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、异钩藤碱、钩藤碱加样回收率均为95%～105%，RSD分别为1.33%、0.25%、0.93%、2.92%，结果表明该方法准确性良好。

2.5 相对校正因子(RCF)计算和相对保留时间(RRT)的确认

分别精密吸取2.2项下的混合对照品溶液，按2.1项下的色谱条件，在不同色谱柱、仪器、流速、柱温条件下进行测定，记录色谱图，按QAMS建立的有关技术指南[9]，以异钩藤碱为参照物，计算其他3种生物碱的RCF与RRT，结果见表3～6。

2.6 RCF验证

取10批钩藤饮片，按2.3项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下的色谱条件分别进行测定，以外标法、QAMS分别计算4种生物碱的含量，结果见表7。结果表明，2种计算方法结果接近，RSD<5%，说明QAMS所得含量准确可靠，该含量测定方法符合方法学要求，可替代外标法，用于钩藤中钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱的含量测定，结果见表7。

表3 钩藤相对校正因子与相对保留时间

表4 不同流速的相对校正因子与相对保留时间

表5 不同柱温的相对校正因子与相对保留时间

表6 不同仪器的相对校正因子与相对保留时间

表7 钩藤饮片供试品溶液中4种生物碱类成分一测多评法和外标法含量测定结果

3 讨论

钩藤中活性成分主要是生物碱，包括钩藤碱、异钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱等化学成分。钩藤碱与异钩藤碱，去氢钩藤碱与异去氢钩藤碱分别为一对同分异构体，均属于吲哚型生物碱。由于结构接近，较难分离[10]。因此，在流动相的选择中，本实验尝试用乙腈-水、甲醇-水，以封端处理的色谱柱进行分离，均不能将4种生物碱分开；当以少量三乙胺为扫尾剂时，峰形明显改善，对称性较好。考虑到三乙胺对色谱柱的影响，实验中也尝试用氨水代替三乙胺，发现4种生物碱也能达到基线分离，但峰形对称性不及三乙胺。本研究中发现，pH对4种生物碱的分离也有一定影响，当pH为7.5～7.6，4种生物碱完全达到基线分离；当pH为7.7～7.9，异去氢钩藤碱与异钩藤碱峰逐渐靠近，分离度减小；当pH在7.5以下时，异去氢钩藤碱与去氢钩藤碱峰逐渐靠近，钩藤碱与异钩藤碱峰逐渐靠近，分离度减小。

目前研究发现，钩藤饮片主要包括五环单帖吲哚型生物碱、四环单帖吲哚型生物碱等[11]，其中钩藤碱与异钩藤碱占有总生物碱的40%以上，异去氢钩藤碱与去氢钩藤碱含量也较高，具有较为明确的药效。钩藤在部分方剂中常要求“后下”，有研究表明，其原因可能是钩藤生物碱不稳定所致，受热易发生转化，因此不宜久煎[12]。杨秀娟等[13]研究进一步发现，钩藤中的生物碱在水提取液中60～80 ℃长时间加热情况下稳定性较差，加热过程中大部分钩藤碱可以转化为异钩藤碱，而异钩藤碱中一部分又可以转化为去氢钩藤碱与异去氢钩藤碱。目前，中药饮片质量标准制订和质量控制思路往往更强调从中药饮片自身原本含有的化学成分来开展相关化学成分分析检测，而较少从中医临床用药方式常为煎汤后服用的角度考虑，因此，难以发现煎煮过程中化学成分变化的规律性，而中药饮片质量评价最终是要为临床用药安全性和有效性服务，有必要兼顾中药饮片水煎煮过程中发生的化学物质转化特点，更全面地反映中药原料的质量。钩藤仅以钩藤碱为检测指标，并不能很好地控制钩藤及其制剂的质量，本研究选择以去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱、钩藤碱、异钩藤碱含量代表钩藤总生物碱含量，为钩藤饮片的质量控制提供参考。