银质针对大鼠肩袖冈上肌骨-肌腱结合部位损伤的修复作用

赵智龙,丁国萍,胡 媛,王芙蓉,马维斌,时 沛,欧阳签

肩袖是维持肩关节稳定和活动的主要解剖结构，肩袖损伤可导致肩关节疼痛与功能障碍，严重影响患者的生活及工作质量[1-2]。随着人口老龄化加剧，肩袖疾病逐渐发展已成为人们一种主要的医疗和经济负担[3]。冈上肌为肩袖的结构组织之一，也是最易受损的肩袖肌结构[4]。西医治疗肩袖损伤的方法以消炎止痛、关节镜等为主，但存在只缓解症状并不能医治其根本，毒副作用较多，手术收费昂贵且术后并发症严重等不足[5]。传统医学认为肩袖损伤是由于风寒痹阻、气滞血瘀后不通则痛而发病，治疗时应祛风散寒、活血化瘀、疏通经络。研究发现，针灸推拿在治疗肩袖损伤方面具有一定的优势[5]。银质针疗法是一种经改良后的特殊针灸疗法，在临床上多用于治疗各种原因导致的疼痛，具有消炎止痛的功效[6]。但关于银质针对肩袖冈上肌损伤的研究却少有报道，因此，本研究通过构建SD大鼠肩袖冈上肌骨-肌腱结合部位损伤来模仿人体肩袖冈上肌损伤，采用银质针进行修复治疗，观察其效果，以期为银质针治疗肩袖损伤提供一定的基础研究资料。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本研究于2019年12月-2020年1月在武汉华联科生物技术有限公司进行。选择39只SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量180～220 g，来源于辽宁长生生物实验动物中心，动物合格证号：1107261911000185。实验动物使用许可证号：SYXK(鄂)2018-0104，饲养环境：温度为22～26 ℃，相对湿度为50%～60%，人工光照明暗各12 h。

1.2 试剂与仪器：戊巴比妥钠购自Sigma(货号：P3761)；苏木精、伊红染液购自北京雷根生物技术有限公司(货号：DH0010、DH0045)；大鼠白细胞介素6(IL-6)ELISA试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒购自武汉贝茵莱生物科技有限公司(货号：RA20607、RA20035)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所(货号：A003-1、A001-1)。0.30×40无菌银质针购自北京科苑达医疗用品厂；微型电钻购自韩国世新；石蜡切片机购自杭州艾普仪器设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 分组与造模：将39只SD大鼠分为3组，其中正常组3只，模型组18只，治疗组18只。正常组大鼠进行正常饲养，模型组和治疗组大鼠均构建肩袖冈上肌损伤模型：采用2%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射大鼠进行麻醉，剪除大鼠左肩部毛发，在肩胛骨下缘切2～3 cm横行皮肤切口，显露出肱骨头。将冈上肌腱骨-肌腱结合部位切断，用微型电钻在原冈上肌附着处建立2个平行的骨性隧道，采用缝合线穿过骨道将冈上肌腱缝合在原位[7]。逐层缝合切口后，进行正常饲养。治疗组在造模后第12天开始进行银质针治疗：采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，俯卧位放置于手术板上，前肢屈曲放于头两侧，左肩关节近肱骨头区均匀涂抹耦合剂，避开皮肤切口处，给予银质针治疗，1周治疗1次。分别于治疗1、2、4周后选取大鼠(正常组1只，模型组6只，治疗组6只)，采用戊巴比妥钠过量麻醉致死，收集大鼠左肩骨-肌腱结合部位组织，进行组织学观察及实验检测。

1.3.2 HE染色:将骨-肌腱结合部位组织浸泡于5倍体积的脱钙液中，置于摇床上振荡，每天更换1次脱钙液，脱钙结束后，流水冲洗骨组织24 h。将骨组织纵切并放置于包埋盒中包埋，切出厚度为3 μm的切片水浴中展开。将组织切片脱蜡至水，水洗1～2 min，加入苏木精染液染色5 min，流水冲洗。加入促蓝液返蓝5 s，流水冲洗，加入0.5%伊红染液染色3 min，蒸馏水冲洗。加入梯度乙醇脱水，二甲苯透明，然后进行中性树脂封片。

1.3.3 ELISA检测:称取0.1 g大鼠骨-肌腱结合部位组织于离心管中，加入0.9 mL PBS，充分匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液。将标准品进行梯度稀释，向酶标包被板标准品孔中加入50 μl标准品，待测孔中加入40 μl上述样本上清液，再加入10 μl抗体。加入50 μl酶标试剂，室温孵育30 min，洗涤5次。加入显色剂，室温避光显色10 min，加入50 μl终止液。酶标仪检测450 nm处各孔的吸光度(OD值)，根据标准品浓度计算出标准曲线的直线回归方程式，计算待测样品的实际浓度。

1.3.4 生化检测：称取0.1 g大鼠骨-肌腱结合部位组织于离心管中，加入0.9 mL PBS，用手持匀浆器将样本充分匀浆，以2 500 r/min离心10 min，取上清液待测。根据试剂盒说明书配制试剂进行实验检测，计算上清液中MDA浓度及SOD活性水平。

2 结果

2.1 组织形态观察:观察各组大鼠左前肢活动情况，模型组大鼠前2周的活动情况均较差，左侧前肢上举无力，或不能上举、外展，严重者有肩部不稳感，第4周逐渐恢复正常；治疗组大鼠经过第1周治疗后，前肢活动情况出现好转，第2周活动恢复正常。采集骨-肌腱结合部位组织观察，与正常组比较，模型组和治疗组损伤愈合处瘢痕增生。随着时间的增加，模型组和治疗组骨-肌腱结合部位损伤愈合处瘢痕增生均减轻，与模型组相比，同一时间段的治疗组瘢痕增生得到缓解。

2.2 HE染色结果比较：正常组大鼠组织中肌腱纤维、软骨以及骨组织层次清楚，呈典型的骨腱结合部组织状排列，而模型组组织细胞排列紊乱，且有炎性细胞浸润，治疗组随着治疗时间的延长，组织病理变化得到改善，细胞排列逐渐恢复正常，炎性细胞浸润减少。

2.3 深化实验检测结果比较：与对照组比较，模型组大鼠骨-肌腱结合部位组织IL-6、TNF-α和MDA水平均显著升高(P<0.05)，而SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型组比较，治疗组骨-肌腱结合部位组织IL-6、TNF-α和MDA水平显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)。与第1周治疗组比较，第2周治疗组IL-6、TNF-α和MDA水平显著降低(P<0.05)，SOD活性显著升高(P<0.05)；第4周治疗组IL-6、TNF-α和MDA水平显著降低(P<0.05)，见表1，说明银质针治疗效果存在一定的时间依赖性。

表1 大鼠骨-肌腱结合部位组织IL-6、TNF-α、MDA和SOD水平比较

3 讨论

有研究报告肩袖损伤占肩关节患者的40%～60%[8-9]，而冈上肌是肩部力量集中的交叉点，为肩袖中受力最大的部位，因此极易受损[10]。肩袖损伤发病率随着年龄的增长而增加，口服药物或局部封闭等保守治疗对于老龄化严重的肩袖损伤所造成的弊端也更加明显[11]。针灸具有疏通经络、调和气血的作用，也可改善局部组织微环境，亦能抑制炎症，进而达到缓解疼痛的作用，对于“筋脉不通、气血凝滞”的肩部疾病具有较好的治疗效果[12]。郭长利等[13]研究发现，针灸配合物理康复锻炼对肩袖损伤的疼痛缓解以及功能恢复是有效的，且未发生并发症。王延武等[14]临床研究结果显示，电针配合Mulligan动态关节松动术对肩袖损伤后的肩关节疼痛具有很好的改善作用，治疗过程中也无不良反应出现。仉乐[15]的研究数据也说明了针灸、推拿配合理疗对于运动性肩袖损伤的治疗效果更优于单纯的理疗。这些临床报告提示针灸对于肩袖损伤具有令人满意的临床疗效，但缺少相应的基础研究。银质针疗法是一种特殊的针刺手法，可松解软组织，刺激痛点，从而达到消炎止痛的作用[6]。本研究采用银质针治疗大鼠左肩袖冈上肌损伤，改善了大鼠的左前肢活动情况，缓解了大鼠骨-肌腱结合部位瘢痕增生，且组织结构变化也得到了恢复，炎性细胞减少，提示银质针对肩袖冈上肌损伤具有较好的治疗效果。

肩袖损伤的发病机制较多，其中包括炎症反应，炎症可使肌腱结构发生变化，使肌纤维排列紊乱[16]。郭锐等[17]发现肩袖损伤大鼠的关节液中炎症因子出现过度表达，当炎症因子逐渐减少时，疼痛逐渐减轻，而IL-6、TNF-α等炎症因子与关节疼痛呈正相关，因此认为这些炎症因子水平可作为肩袖损伤疼痛诊治以及疗效评价的客观依据。也有观点认为，疼痛在一定程度上是氧化应激和炎症所导致的结果[18]。MDA为氧化应激标志物之一，SOD可抑制氧化应激所引起的炎症反应[19]，但关于氧化应激在肩袖损伤中的影响却研究较少。本研究在检测银质针对肩袖损伤大鼠炎症反应影响的同时，也观察了氧化应激指标MDA及SOD，发现肩袖损伤大鼠骨-肌腱结合部位组织的IL-6、TNF-α和MDA水平均显著升高(P<0.05)，而SOD活性减低(P<0.05)，说明肩袖损伤大鼠的炎症反应以及氧化应激水平均出现升高；经过银质针的治疗后，大鼠骨-肌腱结合部位组织的IL-6、TNF-α和MDA水平降低，SOD活性升高(P<0.05)，且随着治疗次数的增加，治疗时间的延长，大鼠IL-6、TNF-α和MDA水平越低(P<0.05)，提示银质针治疗可缓解肩袖损伤大鼠的炎症反应及氧化应激。

综上所述，银质针治疗可改善肩袖冈上肌损伤大鼠的肢体活动情况以及组织病理变化，这一治疗作用可能与抑制大鼠炎症反应及氧化应激水平有关，有待进一步研究。