脑胶质瘤中TERT启动子突变分析及预后研究

刘晓莉，屈玉玲，翟学锋，杨治花

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，其发生发展涉及多种不同的遗传学改变[1-2]，其中端粒酶逆转录酶(TERT)主要通激活端粒酶的活性来维持端粒的完整性，使真核细胞获得无限增殖能力，在正常细胞内表达量低。全基因组关联研究发现,TERT启动子(TERTp)突变与各种肿瘤中mRNA表达获端粒酶活性的增加有关。TERT在大脑胶质瘤中存在较高表达率，主要归结于TERT启动子区2个体细胞点的突变，即C228T和C250T 2个位点，总体突变率约为55%，导致TERTp的转录活性增加[3-4]。已有研究表明,TERTp突变可以作为原发性胶质母细胞瘤不良的独立预后因子，亦可作为该类型较为特异的诊断标志物。除此之外，在低级别胶质瘤中，TERTp与染色体1p/19q联合缺失密切相关[4]。本研究基于弥漫性胶质瘤的组织病理特征，检测不同级别及亚型胶质瘤石蜡组织中TERTp突变情况，并结合随访资料探讨TERTp状态与不同亚型胶质瘤患者预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料:收集宁夏医科大学总医院神经外科2013年6月-2018年9月手术切除并经病理诊断为弥漫性胶质瘤(WHOⅡ-Ⅳ级)的石蜡标本88例，临床及病理资料情况见表1。

1.2 检测方法

1.2.1 石蜡标本提取基因组DNA:采用QIAGEN 公司DNA 提取试剂盒(69505)，严格按照试剂盒说明书的要求进行操作，并采用紫外分光光度计进行质检提取DNA浓度(10 ng/μl≤浓度≤100 ng/μl)。

1.2.2 TERT启动子区突变检测:①从样本 DNA 液中取出 3 μl加至测序反应液1中，予以42 ℃ 5 min、94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s(进行20个循环)扩增；② 取出 TERT 测序反应液2,GC PCR MIX3，按照上述步骤及条件进行10个循环进行扩增，再取5 μl PCR扩增产物，加入 2 μl SAP混合物混匀,予以 37 ℃ 60 min、80 ℃ 15 min 进行酶解；③取以上酶解产物3 μl、测序试剂 1μl和测序引物2 μl 进行PCR扩增，条件为96 ℃ 1 min,96 ℃ 10 s、50 ℃ 5 s、60 ℃ 4 min(25次循环),恒温4 min后将产物进行提纯;④将提纯的产物置于基因分析仪上测序，使用测序分析软件 Chroma 2.0分析数据。

1.3 随访:通过查阅病历资料、电话咨询、门诊随访等方式，对所有患者进行随访，记录患者生存时间。随访截止日期2019年9月30日，随访时间0.9～97.3个月，平均28.4个月。

1.4 统计学方法:采用SPSS 19.0统计软件，用Fisher精确概率法判断TERTp突变与临床病理指标的相关性，用Kaplan-Meier法分析TERTp突变与胶质瘤患者预后相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TERTp突变在弥漫性胶质瘤发生情况:本组88例弥漫性胶质瘤，TERT启动子C228T或C250T突变发生率为63.6%,其中WHOⅡ级占51.4%、Ⅲ级占65.0%、Ⅳ级占74.2%。进一步分析发现，少突胶质细胞来源肿瘤(包括少突胶质细胞瘤和间变型少突胶质细胞瘤)和胶质母细胞瘤中有较高的突变率，分别为61.5%、66.7%和74.2%，见图1(目录后)。

2.2 TERT启动子突变与各临床病理指标的相关性:在本组胶质瘤标本中，TERTp突变(包括C228T和C250T)与患者的年龄(P<0.05)、肿瘤增殖指数呈显著正相关性(P<0.05)，与弥漫性胶质瘤IDH-1突变蛋白表达呈显著负相关性(P<0.05)，与患者术后是否复发也有相关性(P<0.05)，差异具有统计学意义；而与患者的性别、胶质瘤WHO分级之间差异无统计学意义，见表1。

表1 TERT启动子区突变与胶质瘤患者临床病理指标的相关性分析

2.3 TERT启动子突变与患者生存时间相关性分析:88例胶质瘤患者Kaplan-Meier生存曲线分析显示，TERTp突变患者术后生存时间显著低于野生型(P<0.05)。根据胶质瘤起源，将胶质瘤分成星形细胞起源的胶质瘤和少突胶质细胞起源的胶质瘤单独分析，发现TERTp突变在星形细胞源性肿瘤组中与患者的不良预后密切相关(P<0.05)，而在少突胶质细胞源性肿瘤组中与患者术后生存时间无显著相关性(P>0.05)。在老年组中(年龄≥45岁)，TERTp突变患者的生存时间与野生型患者生存时间差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

TERT是端粒酶其中的催化亚单位，当TERT启动子区发生微小遗传学改变时，转录因子的结合序列发生改变，从而增强了TERT转录活性，避免了细胞衰老死亡，促进肿瘤的发生发展[4]。TERTp突变最先于黑色素瘤中发现[5]，并证实在胶质母细胞瘤中突变频率较高。本研究对88例弥漫性胶质瘤进行TERTp突变点检测，检测结果TERTp突变在胶质瘤中总发生频率为63.6%，在31例胶母中的发生频率为74.2%，与Killela研究组报道的74.2%[6]和83.9%[7]基本一致。同时研究分析发现，TERTp突变在少突胶质细胞瘤和间变型少突胶质细胞瘤中突变率较高，分别为61.5%和66.7%；而在星形细胞瘤中突变率仅36.4%。结合TERTp在胶质瘤不同亚型的分布不难发现,除外WHO Ⅳ的胶质母细胞瘤，少突胶质细胞起源的胶质瘤中TERTp突变的比例明显高于星形细胞起源的胶质瘤(包括弥漫性星形细胞瘤和间变型星形细胞瘤)。这一结果提示TERTp可作为弥漫性胶质瘤分型的一个分子指标。再分析其他临床病理学指标与TERTp突变的相关性发现，在45岁及以上的人群组中，发生TERTp突变的胶质瘤患者明显多于未发生突变者(34∶8)，而在45岁以下的群体中无显著差异性，归因于本研究中原发性胶质母细胞瘤患者多为老年人，而TERT启动子突变主要集中在该亚型中。本研究还提示，TERTp突变与肿瘤增殖指数呈显著正相关性，即增值指数而与弥漫性胶质瘤特征性分子标志物IDH-1蛋白表达呈负相关性。IDH-1阴性组中TERTp突变数明显高于野生型，主要是由于大部分胶质母细胞瘤病例富集于IDH-1表达阴性组中，而胶质母细胞瘤中TERTp突变率高达74.2%。单纯依据胶质瘤WHOⅡ-Ⅳ分级因素，结果显示TERTp突变率随着胶质瘤级别的递增略有升高，这种趋势可能与TERTp突变增加了胶质瘤的恶性表型有一定关系。

Kaplan-Meier生存分析显示，突变型患者术后生存时间显著低于野生型患者的生存时间(P<0.05)，与国内外学者报道较一致[6-11]。随后进一步分组分析发现，TERTp突变在星形细胞源性肿瘤中与不良预后密切相关，而在少突胶质细胞源性组中二者并无相关性。因此可以认为，该突变在少突胶质细胞瘤中的突变率虽然相对较高，但并非是预后不良指标；反之，在弥漫性星形细胞瘤到胶质母细胞瘤这一组群，可以作为一个相对特异的预后不良的分子指标。分组预后分析中还发现，在≥45岁的老年患者组中，检测TERTp突变状态对预后有更高的指导意义[8]。

目前，TERTp突变作为一个独立的肿瘤预后指标还存在争议，尤其在IDH-1野生型的胶质瘤患者中。有研究表明，在术后接受正规放化疗的IDH野生型胶质母细胞瘤患者中，联合检测 (MGMT)甲基化状态和TERTp突变可以更精准预测患者的预后；在细化分组中，TERTp突变且MGMT低甲基化患者预后最差，而TERTp野生型伴MGMT高甲基化患者预后较好[11]。结果提示对于胶质瘤患者需要联合检测多个基因，对预测生存期具有更优价值。后续研究将纳入MGMT、ATRX、TP53、EGFR等热点分子改变，进行更加精确的分子分型为基础的预后分析，寻找可能的治疗靶点。