石蜘蛛组织培养与建立体外再生体系探究

张 兰 罗 睿 田 晨 陈海丽

（贵州大学生命科学学院 贵州贵阳 550025）

半夏［P. ternata（Thunb.）Breit.］和石蜘蛛（Pinellia integrifoliaN. E. Brown）都属于天南星科（Araceae）半夏属（PinelliaTenore）植物[1-2]。半夏块茎是一种重要的中药材（国家药典委员会2010），而半夏属的其他植物也常在民间作药用，如石蜘蛛（又名一面锣、白铃子、滴水珠等，是多年生草本植物）具有止痛通窍、解毒散结等功效[3]。半夏的药用价值、活性成分、地理分布、栽培及繁殖技术等已得到了丰富的研究[4-6]，而对我国特有的石蜘蛛的相关研究还非常欠缺，目前仅有刘玎等（2016）对其lectin基因[7]、刘丹等（2018）对其转录组测序及PEBP基因家族成员与珠芽发育关系的分析[8]。石蜘蛛相关研究滞后的一个重要原因在于其自然分布范围狭窄且无人工栽培种植，这导致研究所需原料来源受限，目前已知其分布区域包括湖北宜昌、四川叙永、重庆和贵州赤水等少数地区[3,9]。在对石蜘蛛进一步研究的同时，为了使其野生资源不被破坏，对其快速繁殖的研究也是必不可少的。本文对其体外再生繁殖体系进行了研究，研究结果可为石蜘蛛的进一步开发利用与野生资源保护奠定基础。

1 材料与方法

本研究的石蜘蛛采集自贵州省赤水市桫椤国家级自然保护区内[9]，采集的材料种植于实验室备用。选择盆栽生长良好的植株，用软毛刷刷掉块茎表面土壤及附属物，将材料放置洗涤液中浸泡10 min，然后用自来水对材料表面冲洗2 h。将表面已清洁的植株分选出块茎、叶柄和叶片作为外植体备用。对外植体采取最佳消毒方案（75%酒精消毒60 s、无菌水冲洗3 次，0.1%升汞消毒10 min、无菌水冲洗3次）后吸干表面水分并分割成片状（3 mm×3 mm）或小段（5 mm）备用。

外植体分别接种于添加0.5、1或2 mg/L 6-BA与0.5、1或2 mg/L 2,4-D的MS植物培养基上进行愈伤组织诱导。一个培养瓶接种一个材料，设置环境条件为16 h光照（3 000 lx）/8 h黑暗，温度24±1 ℃（下同）。培养30 d后观察并统计愈伤组织诱导率（污染率）及生长情况（愈伤诱导率=外植体长愈伤的个数/（总接种数-污染外植体数）×100%；污染率=污染外植体数/总接种数×100%）。选取生长良好的石蜘蛛愈伤组织分别接种于添加1.5 mg/L或2.5 mg/L 6-BA与0.3 mg/L或0.5 mg/L IBA的MS植物培养基上进行不定芽分化培养，培养30 d后观察统计石蜘蛛愈伤组织芽分化率（芽分化率=出芽愈伤个数/接种愈伤总个数×100%）及生长情况。选取来自不同部位的外植体的愈伤组织分化形成的不定芽接种到相应用于分化培养的培养基上培养并观察不定芽的增殖效果，30 d后观察统计不定芽的增殖率（芽增殖率=芽总数/接种个数×100%）。等芽长到4 cm～5 cm高就转接到生根培养基上（MS + 0.5 mg/L IBA +0.5 g/L活性炭）或（MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA +0.5 g/L活性炭）培养，培养30 d后观察材料生根情况。

2 实验结果

2.1 石蜘蛛不同外植体的愈伤组织诱导

不同激素配比的培养基中石蜘蛛块茎、叶柄和叶片外植体的愈伤诱导率有明显差异（表1）。9 种激素配比的培养基均可诱导块茎和叶柄愈伤组织的发生，而A8和A9两种激素配比条件下不能诱导叶片愈伤组织的发生。通过观察及统计学分析，块茎和叶片的愈伤组织诱导最适培养基为A5（MS + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D），诱导率分别为96.2%和72.0%；叶柄愈伤组织诱导的最适培养基是A3（MS+0.5 mg/L 6-BA+2 mg/L 2,4-D），诱导率高达96.97%，A5培养基条件下叶柄的愈伤组织诱导率为92.0%，这两种培养基条件下诱导差异不显著。

表1 不同激素配比对石蜘蛛不同外植体愈伤组织诱导的影响

外植体（叶片、叶柄、块茎）接种10 d后，块茎表面开始出现少量淡黄色疏松颗粒的愈伤组织（图1A），叶柄随着愈伤组织的形成逐渐膨大（图1B），叶片边缘形成愈伤组织且由于中部组织的生长而凸起导致其脱离培养基表面（图1C）。30 d之后，叶柄和块茎完全愈伤化，但叶片大部分枯萎变黄，仅边缘有少量愈伤组织。

2.2 来源于不同外植体愈伤组织的不定芽诱导分化和增殖

来源于块茎、叶柄与叶片的愈伤组织都能够分化形成不定芽（如表2）。相比于低浓度细胞分裂素（6-BA 1.5 mg/L）的添加，高浓度细胞分裂素（6-BA 2.5 mg/L）条件下不定芽分化率更高。在低或高浓度细胞分裂素条件下，生长素（IBA）添加量上调或降低细胞分裂素/生长素比值会降低不定芽分化率（除叶片来源愈伤组织在低浓度细胞分裂素添加时）。在B3（MS + A 2.5 mg/L 6-B +0.3 mg/L IBA）培养基中，细胞分裂素含量及细胞分裂素/生长素比值最大，块茎、叶柄与叶片来源的愈伤组织的不定芽分化率分别达到最大，分别为92%、92.3%、94.8%。与不定芽分化相对应的激素条件下增殖培养的结果显示，激素对增殖的影响与对不定芽分化的影响相似。在B3培养基中，块茎、叶柄与叶片来源的不定芽增殖倍数也分别达到最大，分别为12.8倍、8.9倍、10.7倍，且不定芽的长势都较好、健壮（图1D）。

表2 不定芽增殖芽与分化

2.3 石蜘蛛不定芽的生根培养与移栽

在低浓度生长素以及细胞分裂素/生长素比值低的条件下，石蜘蛛不定芽能有效生根（如表3）。在不含细胞分裂素的培养基C2（MS + 0.5 mg/L IBA + 0.5 g/L活性炭）中培养植株生根率达到100%，每株苗具8～15 根，且根长可达10 cm（图1E）。而在添加少量细胞分裂素的培养基C1（MS + 0.1 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L IBA + 0.5 g/L活性炭）中培养植株生根率为87%，具5～8 根，但苗基部产生较多的愈伤组织（图1F）。选取生根培养20 d后株高在5 cm～10 cm、根系发达的健壮植株，室温条件下炼苗3 d～5 d后取出组培苗并将根部培养基清除，进行多菌灵处理，之后用清水冲洗（图1G），然后种植于腐殖土中并置于遮阴环境下，定时灌溉保持环境湿润。移栽苗在移栽1个月以后都能成活（图1H）。

表3 不定芽的生根培养

3 讨论

虽然植物体细胞很容易表现出全能性，任何植物器官、组织和细胞都可作为外植体用于再生系统建立，但已报道的半夏属植物组织培养常用块茎、叶柄和叶片作为外植体。张苏锋等（1998）以半夏块茎、珠芽、叶柄、叶片为外植体诱导愈伤组织，两周后观察发现珠芽作为外植体诱导愈伤组织的诱导率最高且生长迅速[4]。罗成科等（2013）以半夏叶片、叶柄、块茎及根作外植体诱导愈伤组织并进行植株再生培养，培养结果表明叶片作为外植体诱导愈伤组织效果最好[10]。而朱燕燕（2017）及王玉娇等（2012）在研究滴水珠（Pinell cordataN. E. Brown）快速繁殖体系时发现，叶柄比叶片更适合作为外植体诱导形成愈伤组织[11-12]。本试验研究结果表明，石蜘蛛叶片、叶柄及块茎作为外植体进行诱导愈伤组织时，叶片、叶柄两种外植体的愈伤组织诱导率相差不大（见表1），但是块茎外植体的愈伤诱导速度更快。综上所述，不同植物诱导愈伤组织的最适宜外植体不完全一致，导致此结果的可能原因是物种之间的遗传差异。

培养基中添加的植物激素种类、含量及细胞分裂素/生长素的比值极大地影响组织培养过程中的愈伤组织诱导、不定芽分化与增殖、生根。本实验运用统计分析得出石蜘蛛块茎在添加1 mg/L 6-BA和1 mg/L 2,4-D的MS培养基中愈伤诱导率较高（96.2%，见表1），此结果与刘鑫欣等（2011）在半夏愈伤组织诱导上的结果一致[13]。在诱导愈伤组织分化不定芽的培养中，最适半夏不定芽分化的培养基是MS+ 1.0 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA[14]，最适滴水珠不定芽分化的培养基是MS + 2.0 mg/L 6-BA +IBA 0.2 mg/L[15]，而本研究发现3 种外植体来源的石蜘蛛愈伤组织分化不定芽的最佳培养基都是MS + 2.5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L IBA，结果与滴水珠更为一致。在生根培养中，朱燕燕等（2017）发现添加微量6-BA（0.1 mg/L）时滴水珠的生根效果最好。而武宗信等（2005）在半夏的生根培养中发现仅添加0.5 mg/L IAA而不添加6-BA时效果最好[16]。本试验研究结果发现石蜘蛛的生根培养激素条件与半夏一致。半夏属不同植物在进行愈伤组织诱导、不定芽分化及生根培养所需激素种类、浓度异同的原因有待进一步研究。

本试验中，石蜘蛛再生体系建立以叶片和块茎为外植体较佳，愈伤组织诱导最适合培养基为MS + 1 mg/L 6-BA + 1 mg/L 2,4-D，不定芽增殖与分化最适培养基为MS+ 2.5 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L IBA，生根最适培养基为MS+ 0.5 mg/L IBA + 0.5 g/L活性炭。石蜘蛛再生体系的建立可为研究其药用价值及野生资源的开发利用奠定基础。