氢气对蛛网膜下腔出血致急性肾损伤大鼠的保护作用

宋京花，贾红艳，邵天鹏，柳志宝，赵元平

(河北省沧州市中心医院放射介入科，河北 沧州 061000)

蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是最常见的脑血管意外之一，致死致残率较高[1]。既往研究表明，SAH患者1周内的全因病死率高达40%[2]。除疾病本身外，SAH的并发症也是导致其不良预后的重要因素。急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)作为SAH患者常见的严重并发症之一，可显著增加SAH患者的病死率，因此，如何改善SAH合并AKI患者的肾脏功能是急需解决的医学难题之一[3]。氢气作为一种选择性抗氧化剂，具有易穿透细胞膜，可以作用于亚细胞结构，通过参与多种信号通路的调控，选择性清除机体内氧自由基的特点[4]。既往研究表明，氢气能选择性的清除的·OH和ONOO-等能导致细胞损伤的强氧化剂，从而产生抗炎，抗凋亡的作用[5]。已有研究证实，吸入低浓度氢气能减轻SAH大鼠神经元损伤，减轻局灶性脑缺血再灌注损伤[6]。但关于氢气对于SAH导致的远隔器官损伤的保护作用尚不明确，本研究旨在探讨氢气对SAH致大鼠AKI的肾脏功能的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1一般资料 53只SPF级Sprague Dawley雄性大鼠，8～9周龄，体重300～350 g，购自北京维通利华实验动物有限公司(SYXK(京)2012-0036)。所有大鼠饲养于动物房，室温维持在(25±1) ℃，湿度维持(55±5)%，光照/黑暗周期为12 h/12 h。所有大鼠手术前均分笼适应性饲养1周，所有大鼠在实验过程中均参考国家卫生研究院发布的《实验动物护理和使用指南》的建议接受人类护理。

1.2主要设备与试剂 七氟醚购于上海恒瑞医药有限公司；甘露醇购于华仁药业(日照)有限公司；造影剂购于江苏恒瑞医药股份有限公司；ROS试剂盒，苯甲基磺酰氟，裂解液，bak兔多抗，caspase-3单克隆抗体，原位末端标记法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)试剂盒，PVDF膜，SDS-PAGE凝胶，预染彩虹maker，溴酚兰，QuickBlock封闭液，TBS-T，超敏ECL发光液，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)均购于上海碧云天科技有限公司；苏木素，伊红染液购于珠海贝索生物技术有限公司；bcl-2兔多抗购于北京索莱宝科技有限公司；电泳槽购于北京君意东方电泳设备有限公司，型号：JV-ZY6；脱色摇床购于泰州诺米医疗科技有限公司，型号：NYC-80；多功能手术仪(双极电凝)购于武汉春光医疗美容仪器有限公司，型号：CHR-V；小动物麻醉机购于ABM；体温维持仪购于上海玉妍科学仪器有限公司，型号：XMTF-7000；离心机购于湖南安君研仪器有限公司，型号：A16K-R；酶标分析仪购于南京德铁实验设备有限公司，型号：HBS-1096B；荧光显镜购于广州市明美光电技术有限公司，型号：MF43。

1.3动物实验

1.3.1模型制备及验证 采用大鼠颈内动脉穿刺，输注甘露醇和造影剂的方法制备SAH致AKI模型。将大鼠置入预充七氟醚的麻醉箱进行麻醉诱导，待麻醉满意后仰卧位固定于铺有温毯的操作台上，设置肛温<38 ℃时温毯加热，3%～4%七氟醚麻醉维持。在模型制备前经鼠尾静脉采集血液测定血肌酐(serum creatinine，SCr)(0 h SCr)，备皮、消毒、铺巾，正中切口，逐层分离，暴露左颈动脉，结扎离断颈外动脉分支并电凝止血。无损伤血管钳夹闭颈总动脉，颈内动脉。结扎颈外动脉远端并切开拉直，使得其与颈内动脉呈一直线。从颈外动脉将头端磨锐的尼龙线置入，直至有阻力感继续置入3 mm左右，刺破颈内动脉颅内段(20±2) mm，造成SAH，随后撤出尼龙线，结扎颈外动脉近心端，开放颈总动脉，缝合切口，并给予0.25%罗哌卡因局部封闭镇痛。随后从鼠尾静脉分别缓慢静注甘露醇9 g/kg，注入造影剂2 mL。对照组模型除不刺破大脑中动脉血管其余操作均相同。所有大鼠均回笼单独饲养。模型制备后24 h(24 h SCr)经鼠尾静脉采集血液测定SCr。24 h SCr>1.5×0 h SCr认为SAH致大鼠AKI模型制备成功。

1.3.2实验分组 制备对照组12只，无死亡；制备SAH致AKI模型使用大鼠41只，死亡8只，SAH致AKI模型(24 h SCr>1.5×0 h SCr)成功24只，随机分为模型组(n=12)和氢气治疗组(n=12)。制备模型成功后24 h和48 h时，将氢气治疗组大鼠置入预充2.9%浓度氢气的麻醉诱导箱中2 h，将模型组和对照组大鼠置入预充空气的诱导箱2 h。

1.3.3AKI血清学参数分析 各组大鼠在组织灌注前，从主动脉采集血样0.7～1.0 mL，测定BUN和SCr水平。

1.3.4苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)测定大鼠肾脏病理改变 模型制备成功后72 h，在6%七氟醚深度麻醉下，迅速去除胸骨打开胸腔，充分暴露心脏，于心尖处取血2 mL，随后使用连接输液器的穿刺针从心尖部位插入，向上进针到升主动脉并使用血管钳固定。剪开右心耳后使用生理盐水灌注，直至肝，肾和肺脏颜色转白，右心耳流出的液体清亮后，灌注10%甲醛250 mL，摘取右肾(n=6)。经固定、脱水、透明、浸腊、包埋后，切制5 μm石蜡切片。经二甲苯Ⅰ、Ⅱ分别浸泡10 min后，不同浓度梯度酒精(100%，90%，80%，70%)脱蜡，各2 min，随后置入苏木素染液中染色6 min，水化30 min后置入伊红染色液中染色3 min，水洗2 min后置入不同浓度梯度酒精(70%、80%、90%、100%)脱水，各30 s，再放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中分别透明10 min，滴加中性树胶后封片，观察。肾脏病理评分依据Paller评分法：即每高倍镜视野随机选择10个有病变的肾小管，按100个肾小管记分，肾小管明显扩张、细胞扁平记1分；刷状缘损1分，脱落记2分；肾小管管腔内有脱落的、坏死的细胞包括未成管型或细胞碎片记1分，管型记2分。

1.3.5肾脏组织活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平的测定 模型制备成功后72 h，在8%七氟醚麻醉下摘取右肾，将0.1 mL含1 mg肾脏皮质组织、2.9 mL ROS分析介质和15 nmol/L 2′，7′-二氯氟二乙酸混匀后，在37 ℃温箱中孵育15 min，酶标仪测定488 nm激发波长，525 nm发射波长下的荧光值。

1.3.6蛋白印迹法测定大鼠肾脏组织B淋巴细胞瘤2 (B-cell lymphoma-2,bcl-2)、bcl-2相关蛋k(bcl-2 associated-k,bak)以及裂解的半胱氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)蛋白表达 模型制备成功后72 h，每组取6只大鼠的肾脏组织100 mg(n=6)。充分剪碎、研磨组织，加入500 μL苯甲基磺酰氟和500 μL裂解液进行组织匀浆，在4 ℃，12 000 r/min，半径=8 cm条件下离心5 min，取上清采用二喹啉甲酸法测定蛋白含量。计算含30 μg蛋白的溶液体积即为上样量，加入上样缓冲液后于水中煮沸5 min至蛋白变性，加入10% SDS-PAGE凝胶上样孔中，恒压80 V电泳至预染彩虹预染蛋白分离清晰，溴酚兰即将跑出凝胶。随后采用80 V恒压湿转50 min，将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜，随后移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。TBS-T缓冲液洗涤聚偏二氟乙烯膜后，分别加入bcl-2(1∶1 000)，bak(1∶1 000)，caspase-3(1∶1 000)一抗，4 ℃过夜。TBS-T洗膜3次，每次5 min。加入辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(1∶1 000)室温下孵育1 h。TBS-T缓冲液洗膜3次每次5 min。加入ECL发光液，在脱色摇床上反应5 min，发光仪显影。GAPDH作为内参蛋白，以目的蛋白与内参蛋白条带的灰度比值表示蛋白表达水平。

1.3.7免疫荧光法测定大鼠肾脏细胞凋亡率 每组取6只大鼠的肾脏石蜡切片(n=6)，在二甲苯Ⅰ、Ⅱ各浸泡10 min以及不同浓度梯度酒精(100%、90%、80%、70%)脱蜡后，置于装有PBS的染色缸中洗片3次，每次5 min。滴加20 μL不含DNase的蛋白酶K，于37 ℃温箱中孵育反应35 min，置于装有PBS的染色缸中洗片3次，每次5 min。随后加入TUNEL检测液，在37 ℃温箱中避光孵育60 min，置于装有PBS的染色缸中洗片3次，每次5 min，滴加含DAPI的封片液，盖玻片封片，荧光显微镜下进行观察。计算TUNEL/DAPI双阳性细胞数占总细胞的百分比即为细胞凋亡率，计数5个高倍视野取平均值。

1.4细胞实验

1.4.1肾小管上皮细胞的培养及分组 肾小管上皮细胞系NRK52E用含10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2恒温箱培养，每天换液1次，待细胞融和至90%，加入胰蛋白酶进行消化传代，取对数生长期细胞用于实验；模型组用300 μmol/L过氧化氢干预24 h建立氧化应激损伤模型，氢气治疗组在过氧化氢干预后24 h和48 h分别给予2.9%氢气处理2 h。

1.4.2肾小管上皮细胞丙二醛(malonaldehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)测定 待细胞干预结束后取各组细胞培养基1 mL，按照试剂盒说明书要求处理样品，硫代巴比妥酸法检测MDA，黄嘌呤氧化法检测SOD，按照试剂盒步骤操作。每次设3个复孔，重复3次。

1.4.3流式细胞仪检测肾小管上皮细胞凋亡水平 各组细胞干预后培养2 d，添加0.25%胰蛋白酶后收集各组细胞，用150 μL缓冲液将各组细胞悬浮，添加Annexin V-FITC约10 μL后，避光孵育15 min。添加5 μL PI均匀混合，继续添加150 μL缓冲液，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡率，每次设3个复孔，重复3次。

1.4.4四甲基偶氮唑蓝(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT)法检测细胞存活率 各组细胞接种于96孔板上，每孔避光加入5 g/L的MTT溶液20 μL，继续孵育 4 h。弃去培养液，每孔加入二甲基亚砜150 μL，于微量振荡器上水平缓慢振荡1 min，待充分结晶沉淀后，用酶联检测仪检测波长570 nm处的吸光度(optical delnsity，OD)值，计算存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%。

1.5统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析和Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1氢气治疗对大鼠BUN和SCr水平的影响 模型组和氢气治疗组大鼠BUN和SCr水平高于对照组，氢气治疗组大鼠BUN和SCr水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠BUN和SCr水平比较Table 1 Comparison of blood urea nitrogen and serum creatinine of rats in each group

2.2氢气治疗对大鼠肾脏病理改变的影响 HE染色结果显示：对照组大鼠肾脏组织结构清晰，细胞排列紧密，细胞核及细胞质染色均匀，仅见少量肾小管上皮细胞刷状缘。模型组大鼠肾脏组织可见大量小管上皮细胞肿胀、颗粒及空泡变性；部分小管上皮细胞刷状缘、扁平、皱缩、脱落、核深染、裸露，严重部位见弥漫性细胞片状崩解、坏死，脱落，基底膜不完整；部分肾小管管腔扩张，管腔内可见上皮细胞碎片，肾间质水肿，充血及出血明显。氢气治疗组组织肾小管肿胀、充血、出血及细胞核脱落情况明显减轻(图1)。模型组和氢气治疗组大鼠肾小管损伤评分高于对照组，氢气治疗组大鼠肾小管损伤评分低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图1 各组大鼠肾脏组织HE染色(×100)

表2 各组大鼠肾小管损伤评分比较Table 2 Comparison of renal tubular injury of rats in each group 分)

2.3氢气治疗对大鼠肾脏组织中ROS水平的影响 模型组和氢气治疗组大鼠肾脏组织中ROS水平高于对照组，氢气治疗组大鼠肾脏组织中ROS水平低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠肾脏组织ROS水平比较Table 3 The content of ROS in the renal tissue of rats in each group

2.4氢气治疗对大鼠肾脏组织中bcl-2、bak和cleaved caspase-3蛋白表达的影响 模型组和氢气治疗组大鼠肾脏组织bcl-2/bak蛋白比值低于对照组，cleaved caspase-3蛋白表达高于对照组；氢气治疗组大鼠肾脏组织bcl-2/bak蛋白比值高于模型组，cleaved caspase-3蛋白表达低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表4。

图2 各组大鼠肾脏组织bcl-2、bak、cleaved caspase-3和内参的蛋白印记

表4 各组大鼠肾脏组织bcl-2/bak比值和cleaved caspase-3蛋白表达比较Table 4 Comparison of bcl-2/bak ratio and cleaved caspase-3 expressions in the renal tissue of rats in each group

2.5氢气治疗对大鼠肾脏细胞凋亡率的影响 模型组和氢气治疗组大鼠肾脏细胞凋亡率高于对照组，氢气治疗组大鼠肾脏细胞凋亡率低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组大鼠肾脏细胞凋亡率比较Table 5 Apoptotic rate of renal cells of rats in each group

2.6氢气治疗对氧化应激肾小管上皮细胞MDA、SOD、存活率和凋亡率的影响 模型组和氢气治疗组肾小管上皮细胞MDA水平和凋亡率高于对照组，SOD水平和存活率低于对照组；氢气治疗组肾小管上皮细胞MDA和凋亡率低于模型组，SOD和存活率高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 各组肾小管上皮细胞MDA、SOD、凋亡率和存活率比较Table 6 Comparison of malondialdehyde,superoxide dismutase,apoptotic rate,and survival rate of tubular epithelial cells in each group

3 讨 论

SAH是一种严重威胁人类生命健康的急危重症，其中85%出血原因为颅内动脉瘤破裂，临床上主要表现为颅内压升高、患者意识减退甚至消失[7]。目前认为早期脑损伤是SAH致死致残的主要原因，其病理生理机制主要包括动脉瘤破裂后的机械性损伤、颅内压升高、脑血流量降低、脑灌注压下降、大脑皮质广泛去极化、细胞凋亡和坏死自噬作用、离子稳态破坏、炎症反应、血脑屏障破坏等[8-10]。早期脑损伤在损伤神经功能的同时，也导致了全身应激反应、炎症反应以及神经体液改变等，进而导致心脏、肺、肾及胃肠道等远隔器官的损伤[11-12]。甘露醇作为降低颅内压既经济又有效的药物，常应用于SAH患者，造影剂是SAH介入诊断及治疗的必备药，两者的应用均可加重肾脏负担。本研究参考文献[13]通过颈外动脉置管，经颈内动脉刺破大脑中动脉，制备SAH模型，并在造模成功后经鼠尾静脉给予甘露醇及造影剂，模拟了SAH患者的入院诊治过程，将24 h SCr高于1.5倍基础 SCr定为AKI。本研究结果表明，SAH大鼠应用造影剂及甘露醇后，肾功能受损，AKI发生率约为70%，提示SAH诱发的大鼠AKI模型建立成功。

既往研究表明，SAH早期诱发的儿茶酚胺大量释放，导致外周器官缺血缺氧，并诱发多种炎性因子活化；SAH可诱发脑血管痉挛，缺氧后的脑组织造成线粒体能量耗竭，多种氧离子及过氧化氢生成，血脑屏障完整性下降，炎性因子及氧自由基释放入血，进一步加重全身炎性反应[14]。肾脏作为血流量最大的外周远隔器官之一，SAH诱发的AKI是临床中最为常见的并发症之一，已有研究表明，SAH诱发的AKI可能与小管上皮细胞氧化应激、炎症反应，进一步诱导肾小管上皮细胞凋亡反应有关[15]。线粒体作为氧化应激反应的主要靶点，缺血再灌注损伤可导致ROS水平急剧升高，诱导凋亡因子bak活化，导致线粒体外膜通透性增强，进而诱发细胞凋亡；bcl-2作为最重要的抗凋亡因子，通过抑制bak活化，保持线粒体膜完整性，抑制细胞凋亡[16]。既往研究表明，bcl-2/bak比值的改变可调控细胞凋亡，bcl-2/bak比值下调，表明细胞正在发生凋亡[17]。caspase-3作为凋亡级联反应的最后一级，活化后裂解为cleaved caspase-3，通过进入细胞核切割DNA，诱发细胞凋亡[17]。本研究结果显示，SAH后大鼠肾脏组织ROS水平升高，bcl-2/bak比值下调，cleaved caspase-3表达上调，肾脏组织细胞凋亡率升高，SCr、BUN及肾损伤评分升高，提示了SAH相关性AKI与氧化应激后诱发肾小管上皮细胞凋亡相关。

氢气作为一种无色无味不易溶于水的气体，近年来被发现其具有强大的抗氧化作用；与其它吸入性治疗药物比较，具有易扩散、起效快、无明显不良反应等优点[18]。Jiang等[19]报道，吸入2%氢气能选择性清除·OH和ONOO-，减轻脑缺血再灌注引起的氧化应激损伤；Kumagai等[20]研究表明，氢气通过抑制线粒体生成过氧化物，显著减轻SAH诱发的神经细胞凋亡。本研究通过模拟SAH诱发的AKI型，在SAH后24 h、48 h时吸入2.9%氢气2 h进行治疗，结果显示，氢气治疗组SCr、BUN及损伤评分减低，表明氢气对SAH诱发的AKI具有保护作用；氢气显著减少了肾组织中的ROS含量，bcl-2/bak比值上调，肾脏细胞凋亡率降低，cleaved caspase-3表达下调，表明，氢气对SAH诱发AKI的保护作用与减轻氧化应激，抑制肾细胞凋亡相关。

为了进一步证实氢气对SAH诱发AKI的保护作用，本研究采用过氧化氢处理肾小管上皮细胞的体外模型，结果显示，与单纯过氧化氢处理肾小管上皮细胞比较，氢气可显著降低过氧化氢处理的肾小管上皮细胞中的MDA水平，并增加SOD水平，同时肾小管上皮细胞凋亡率显著降低。表明氢气减轻SAH诱发AKI的机制与其抑制氧化应激减少肾小管上皮细胞凋亡相关，与Ming等[21]的研究结果一致。

综上所述，氢气对SAH致AKI大鼠具有保护作用，其机制与氢气能减少ROS产生，减少氧化应激，上调bcl-2/bak比值从而抑制肾脏细胞凋亡有关。