茉莉酸甲酯处理对‘黑比诺’葡萄果皮酚类物质及其抗氧化活性的影响

孙永蓉，宫鹏飞，李蔚，姚静，宋菲红，韩舜愈*

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(甘肃省葡萄与葡萄酒工程学重点实验室，甘肃 兰州，730070) 3(甘肃省葡萄与葡萄酒产业技术研发中心，甘肃 兰州，730070)

黑比诺属欧亚种葡萄品种，具有早熟、果皮薄、色淡、产量低等特点，甘肃武威地区是种植黑比诺面积最大的产区，其中，莫高是该地区内最具代表性的酿酒葡萄种植基地[1]。黑比诺对于种植环境要求较为苛刻，在炎热的气候下，由于该品种皮薄且果穗接合紧密，其对光强度耐受性不足，果粒之间易潮湿，易出现真菌和霉菌腐烂现象，造成大量减产[2]。

葡萄中酚类化合物种类繁多，均具有一个或多个羟基苯环的共同结构，其不仅赋予果实特殊色泽和风味，而且具有较强的抗氧化能力，能有效清除自由基，抑制脂质过氧化，保护机体生物大分子[3]。此外，酚类化合物作为植物代谢过程中重要的次生代谢产物[4]，能够介导植物防御不同的生物和非生物胁迫，进而改善果实品质。

茉莉酸甲酯(methyl jasmonate，MeJA)是茉莉酸的一种衍生物，存在于多种植物组织中，主要起到信号调节作用，可以调控植物次生代谢，激活多种防御基因的表达，提高植物对生物胁迫和非生物胁迫的抗性[5]。目前，已有研究表明MeJA在苹果[6]和鲜食葡萄[7]中的应用能够提高果实酚类物质的含量。此外，MeJA通过调节果蔬组织中苯丙烷代谢过程中相关的酶基因的表达，增强某些与抗氧化相关的酶的活性，进而有效提高果蔬抗氧化能力[8]。近年来，MeJA也逐渐开始应用于酿酒葡萄，据PORTU等[9]和ENCARNA等[10]研究表明，在酿酒葡萄中应用MeJA会促进果实中酚类物质累积，主要包括总酚、黄酮醇和茋类，但葡萄品种和生长时期的不同会导致果实中酚类物质的种类和含量存在差异。

目前，关于MeJA处理对酿酒葡萄酚类物质含量及其特性的研究报道较多[11-12]，但关于采前MeJA处理对不同生长阶段酿酒葡萄主要酚类物质及抗氧化酶活性的报道研究较少，特别是对于黑比诺葡萄的研究未见报道。因此，本试验以黑比诺为原料，通过在转色初期及1周后对其进行MeJA喷施处理，在不同时期采样并分析果皮中总酚、总花色苷、总类黄酮和黄烷-3-醇含量的变化，明晰MeJA处理对葡萄不同生长阶段果实抗氧化能力和抗氧化酶活性的影响，为提高黑比诺葡萄果实中酚类物质含量及其抗氧化特性以及酿造高品质的黑比诺葡萄酒提供一定的理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

茉莉酸甲酯(MeJA)、DPPH、(+)-儿茶素、芦丁、p-二甲基氨基肉桂醛[p-(dimethylamino)cinnamic aldehyde，p-DMACA],美国Sigma公司；吐温-80，天津市凯信化学工业有限公司；甲醇、三氯化铁、铁氰化钾、三氯乙酸、没食子酸等均为分析纯，成都市科隆化工有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-100E型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；TU-1810紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；H2050R台式高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；DK-S12电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；1510型全波长酶标仪，美国赛默飞世尔仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 田间试验

试验于2020年在甘肃莫高葡萄庄园园区进行，该产区于2014年定植，年均降雨量为191 mm，年均日照时数为2 724.8 h，≥10 ℃的有效积温在2 800～3 200 ℃。选取长势基本一致的黑比诺酿酒葡萄，在转色初期及1周后，对葡萄整株喷施MeJA，喷施浓度为1.0 mmol/L，5株葡萄1个平行，每株喷施量约为200 mL。MeJA用无水乙醇溶解后，用蒸馏水定容，使乙醇体积分数达到1.0%，且加入体积分数为0.1%的吐温-80。以1.0%无水乙醇和0.1%吐温-80的水溶液为对照[7]。具体采样时期如表1所示。

表1 采样时期Table 1 Sampling period

1.3.2 葡萄皮多酚类物质提取

参照郭泽美等[13]的方法，并略作修改。准确称取1.50 g葡萄皮粉末，用15 mL酸化甲醇溶液[1 mol/L，V(HCl)∶V(甲醇)∶V(水)=1∶80∶19]，在100 W、25 ℃功率条件下超声辅助提取30 min，然后8 000×g低温离心15 min，收集上清液，合并提取液。

1.3.3 酚类物质的测定

总酚采用福林-肖卡法[14]进行测定，结果以没食子酸等价值表示(mg/g)。

总类黄酮采用NaNO2-AlCl3比色法[15]进行测定，结果以芦丁等价值表示(mg/g)。

总黄烷-3-醇采用p-DMACA-盐酸法[16]进行测定，结果以儿茶素等价值表示(mg/g)。

总花色苷采用pH示差法[17]进行测定。将提取液用pH 1.0的缓冲液稀释20倍。室温平衡15 min后分别在521 nm处和700 nm处测定吸光度值。用同样的方法测定样品在pH 4.5缓冲溶液中的吸光度值，计算如公式(1)所示:

(1)

式中：A=(A521nm-A700nm)pH 1.0-(A521nm-A700nm)pH 4.5；M(相对分子质量)=493.2 g/mol(锦葵色素-3-葡萄糖苷)；DF为稀释倍数；1 cm为光程;ε=28 000，摩尔吸光系数，L/(mol·cm)。

1.3.4 抗氧化活性的测定

1.3.5 抗氧化酶活性测定

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)活性采用上海优选生物科技有限公司SOD和CAT试剂盒进行测定。取0.1 g 冷冻样品，加入1 mL相对应的提取液，4 ℃，8 000×g离心10 min，上清液即为粗酶液，用于SOD和CAT酶活性的测定。按试剂盒说明测定相应的吸光度值，酶活性均以U/g FW表示。

1.4 数据分析

所有试验数据均重复3次，试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示。采用Excel 2007数据分析工具进行数据整理，利用SPSS 22.0对试验数据进行差异性(最小显著性差异法，P<0.05)分析。采用OriginPro 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 MeJA处理对葡萄果皮中酚类物质含量的影响

酚类化合物是葡萄果皮中重要的次生代谢产物，也是影响葡萄酒色泽、口感和香气物质释放的重要因素[20]，主要通过苯丙烷代谢和类黄酮代谢途径产生，具有重要的抗氧化活性。

由图1-A和图1-B可知，从T1到T6时期，MeJA处理的葡萄果皮中总酚和总类黄酮含量变化趋势基本相同，分别在T2和T4时期出现峰值，且T4>T2，在T6时期，总酚和总类黄酮含量升至仅次于T4时期，分别为11.58和12.19 mg/g，与孙晓文[21]的研究结果相似。MeJA处理后，在成熟过程中‘圣诞玫瑰’葡萄果实总酚和总类黄酮含量提高，且出现了2次峰值。此外，与对照相比，在T6时期，MeJA处理的葡萄果皮中总酚和总类黄酮含量显著高于对照54.44%和54.72%(P<0.05)。

由图1-C可知，从T1到T6时期，MeJA处理的葡萄果皮中总花色苷含量持续上升，从T1时期的0.97 mg/g逐渐上升至T6时期的4.43 mg/g，而对照葡萄果皮中总花色苷含量从T1时期的0.89 mg/g先迅速上升至T5时期的3.38 mg/g，在T6时期轻微下降至3.36 mg/g。在T6时期，处理组葡萄果皮中的总花色苷显著高于对照31.87%(P<0.05)，这与前人在Monastrell葡萄中发现的结果基本一致[22]。

由图1-D可知，随着葡萄果实的成熟，对照和处理组果皮中总黄烷-3-醇含量均呈现先下降后上升的趋势。在T5时期降到最低(0.43和0.58 mg/g)后，又上升至T6时期(0.47和0.78 mg/g)，并且处理组葡萄果皮中总黄烷-3-醇的含量均高于对照组。与对照组相比，除T2和T3时期外，MeJA处理的葡萄果皮中总黄烷-3-醇含量显著高于对照(P<0.05)。RUIZ等[22]也观察到MeJA在Monastrell中的应用导致第二年葡萄中黄烷醇总量增加，但PORTU等[23]研究发现，将MeJA应用于丹魄葡萄中，花色苷显著增加，而黄烷醇含量没有显著性差异。这可能是由于气候条件、品种和地理位置的不同而造成的。

综上，MeJA处理可促进葡萄果皮中总酚、总花色苷、总类黄酮和总黄烷-3-醇含量的积累，可能是由于MeJA诱导酚类化合物的相关合成酶(例如苯丙氨酸氨裂解酶，芪合酶，查尔酮合成酶或花色素苷合酶)[24]，从而提高黑比诺葡萄果皮中酚类物质的含量，但具体机理有待进一步研究。

A-总酚；B-总类黄酮；C-总花色苷；D-总黄烷-3-醇图1 MeJA处理对葡萄果皮中总酚、总类黄酮、总花色苷和总黄烷-3-醇含量的影响Fig.1 Effect of MeJA treatment on the contents of total phenols, total flavonoids， total anthocyanins and total flavan-3-ols in grape peel 注：不同小写字母代表显著性差异(P<0.05)(下同)

2.2 MeJA处理对葡萄果皮中抗氧化能力的影响

2.2.1 MeJA处理对葡萄果皮中DPPH自由基清除率和铁氰化钾还原力的影响

酚类物质在果蔬体内含量丰富，具有较强的自由基清除能力，有研究表明，植物的抗氧化能力在很大程度上取决于其酚类物质的种类和含量[25]。为了更全面地揭示酚类物质的抗氧化效果，可采用多种方法来评价样品的抗氧化能力。因此本研究采用了DPPH自由基清除率和铁氰化钾还原力方法系统评价了MeJA处理的葡萄果皮酚类提取物对自由基的清除能力(图2)。

由图2-A可知，随着葡萄果实生长期的推进，对照和MeJA处理的葡萄果皮中DPPH自由基清除率均呈现先下降后上升的趋势，在T1至T4时期内DPPH自由基清除率缓慢下降，T4至T6时期内DPPH自由基清除率缓慢上升，在T6时期，对照和MeJA处理的葡萄果皮中DPPH自由基清除率分别为80.67%和82.07%。除T1和T2时期外，其他时期处理组葡萄果皮中DPPH自由基清除率高于对照组。

由图2-B可知，葡萄果皮中铁氰化钾还原力的变化趋势和总酚的类似，从T1到T6时期，处理组和对照组的葡萄果皮中铁氰化钾还原力动态变化均有2个峰值，分别在T2和T4时期，在T6时期，MeJA处理组的葡萄果皮中铁氰化钾还原力上升至0.28，而对照组的葡萄果皮中铁氰化钾还原力下降至0.17。与对照组相比，处理葡萄果皮中铁氰化钾还原力随着葡萄果实的成熟均显著提高(P<0.05)。综上，MeJA提高葡萄果皮中DPPH自由基清除率和铁氰化钾还原力。

A-DPPH自由基清除率；B-铁氰化钾还原力图2 MeJA处理对葡萄果实中DPPH自由基清除率 和铁氰化钾还原力的影响Fig.2 Effect of MeJA treatment on the capacity of DPPH radical scavenging activity and potassium ferricyanide reducing power in grape peel

活性氧的积累，会使膜脂产生氧化作用，膜的功能产生变化，引起一系列生理生化作用的异常变化从而产生代谢紊乱，致使植物受到伤害[26]。因此，活性氧的有效清除对于提高葡萄果实抗氧化能力具有重要意义。

图3 MeJA处理对葡萄果皮中和H2O2含量的影响Fig.3 Effect of MeJA treatment on the content of and H2O2 in grape peel

2.3 MeJA处理后葡萄果皮中酚类物质含量与抗氧化能力的相关性分析

表2 MeJA处理后葡萄果皮中酚类物质含量与 抗氧化能力的相关性Table 2 Correlation analysis between the phenolic contents and antioxidant capacity of grape peel with MeJA treatment

2.4 MeJA处理对葡萄果皮中SOD和CAT酶活性的影响

A-SOD；B-CAT图4 MeJA处理对葡萄果皮中SOD和CAT活性的影响Fig.4 Effect of MeJA treatment on the activity of SOD and CAT in grape peel

由图4-A可知，从T1到T6时期，对照葡萄果皮中的SOD活性均小于处理组。2种处理葡萄果皮中SOD活性均呈现下降的趋势，分别从T1时期的399.28和459.78 U/g FW逐渐下降至77.10和132.59 U/g FW(T6)。在T6时期，与对照组相比，MeJA处理的葡萄果皮中SOD活性显著提高了71.98%(P<0.05)。

由图4-B可知，在葡萄生长期间，MeJA处理后葡萄果皮中CAT活性从起始(T1)的17.84 U/g FW先迅速上升至T4时期的36.10 U/g FW，然后逐渐下降至21.02 U/g FW(T6)；而对照葡萄果皮中CAT活性从起始(T1)的15.22 U/g FW先上升至20.11 U/g FW(T2)，又下降至17.84 U/g FW(T3)，然后逐渐上升至26.02 U/g FW(T5)，最后下降至18.95 U/g FW(T6)。在T6时期，MeJA处理葡萄果皮中CAT活性比对照高10.92%。该结果与ZHANG等[30]研究结果基本一致，发现在葡萄上应用MeJA，可诱导CAT和SOD活性提高，降低果实内活性氧的积累。上述结果表明，MeJA处理可提高葡萄果皮中抗氧化酶活性，能够有效清除过量活性氧，维持活性氧稳态。

3 结论