复合乳酸菌发酵酸乳贮藏期稳定性及其风味物质的研究

王磊，宗丽娜，高宗露，鲁茂林，王文琼，陈大卫，徐粉林，顾瑞霞*

1(江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室(扬州大学)，江苏 扬州，225127)2(维维食品饮料股份有限公司，江苏 徐州，221000)

乳酸菌是工业上重要的细菌之一，广泛应用于发酵食品工业，尤其是酸乳的生产。酸乳是最受欢迎的发酵乳制品之一，通常使用嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)和德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)复合发酵[1]，其中徳氏乳杆菌保加利亚亚亚种可以在发酵过程中通过同型乳酸发酵将乳糖转化为乳酸，并且将蛋白质降解为肽类和氨基酸，从而为乳制品提供特有的质地、风味，同时赋予乳制品特殊的益生功效以及营养价值[2]。嗜热链球菌在酸乳发酵前期产酸、产黏等方面发挥着重要作用[3-4]，产酸能力强的嗜热链球菌有助于提高酸奶产品产酸速率、缩短发酵时间，从而提高生产效率、降低酸乳生产成本[5]，并且有研究表明两者在发酵过程中表现出共生的关系[6-8]，因此，将两者进行共发酵有利于提升发酵剂的整体性能。国内外学者对发酵乳中的风味物质进行了大量研究，但对发酵乳制品贮藏过程中产生的风味物质研究很少。发酵乳制品中含几百种含量较低的风味物质，固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)法和气相色谱-质谱(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)联用技术是目前发酵乳制品风味研究中较为常见的研究手段。

酸乳发酵剂是酸乳生产的核心技术，但目前我国酸乳发酵剂中90%以上来自于国外生产。因此，筛选出优良的发酵剂菌株至关重要。本文将不同发酵特性的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种进行复合发酵，测定其单一及复合菌株发酵酸乳的发酵性能和贮藏期稳定性，并结合感官评价及SPME-GC-MS对单菌株及复合菌株发酵的酸乳贮藏前后风味物质变化进行检测分析，以期为酸乳发酵剂的优化设计提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 实验材料

MRS肉汤、M17肉汤，青岛海博；脱脂乳粉、全脂乳粉，新西兰威士兰乳业公司；琼脂、甘油、吐温-80、NaCl、HCl、NaOH，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 实验材料

嗜热链球菌HST-6、嗜热链球菌HST-9和德氏乳杆菌保加利亚亚种KDB-1，扬州大学江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室。

1.1.3 仪器与设备

Trace ISQ气相色谱质谱联用仪，美国Thermo公司；DB-5MS弱极性色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 um)，美国安捷伦公司；手动固相微萃取进样手柄、50/30 μm DVB/CAR on PDMS萃取头，上海安普实验科技股份有限公司；SX-500蒸汽灭菌锅，日本TOMYG公司；SW-CJ-1F超净工作台，苏州净化设备有限公司；GYB60-08高压均质机，上海东华高压均质机厂；PL2002电子天平，梅特勒公司；HH6恒温水浴锅，国华电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化及全脂乳的制备

1.2.1.1 菌株活化

将冻干保藏管中的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种接种于MRS/M17液体培养基中，在平板中划线，挑选单菌落培养，按照3%的接种量转接活化2次，然后按照3%的接种量接种于12%(质量分数)脱脂乳培养基中，待凝乳后，于4 ℃保藏备用。

1.2.1.2 全脂乳的制备

将蒸馏水预热至50 ℃，加入12%(质量分数)全脂乳粉混匀，待温度上升至60 ℃时，加入质量分数为6.5%的蔗糖溶解搅拌，使其充分混合，过200目筛，均质(18～21 MPa，循环2次)，95 ℃热处理10 min，冷却至4 ℃备用。

1.2.2 样品的制备

将德氏乳杆菌保加利亚亚种KDB-1、嗜热链球菌HST-6、HST-9、德氏乳杆菌保加利亚亚种与2种嗜热链球菌等比例组成的2菌株复合发酵剂HST-6+KDB-1(组合1)、HST-9+KDB-1(组合2)和3菌株等比例复合发酵剂HST-6+HST-9+KDB-1(组合3)，以5×106CFU/mL的添加量接种于灭菌后的全脂乳培养基中，42 ℃水浴10 min后，立即置于42 ℃培养箱中恒温发酵，观察其凝乳情况，并对菌株发酵完成及贮藏期间各时间点(贮藏0、1和14 d)取样，用于后续各项发酵特性指标的测定。

1.2.3 相关指标的测定

1.2.3.1 发酵时间的确定

将活化好的菌株以5×106CFU/mL的添加量接种到全脂乳培养基中，于42 ℃条件下恒温发酵，每隔2 h测定1次样品的pH和酸度。待样品pH降低到4.60～5.00，记录发酵完成时间。

1.2.3.2 活菌数的测定

乳酸菌活菌数的测定参考GB 4789.35—2016《食品微生物学检验 乳酸菌检验》[9]。

1.2.3.3 滴定酸度的测定

滴定酸度的测定参考GB 5009.239—2016《食品安全国家标准 食品酸度的测定》[10]。称取5 g酸乳样品，记录质量m，用40 mL蒸馏水稀释，并加酚酞指示剂，用0.1 mol/L的NaOH滴定至微红色，30 s内保持不变色，记录消耗的NaOH滴定量V，按公式(1)计算样品酸度：

(1)

1.2.3.4 pH值的测定

采用pH计测定酸乳样品的pH。

1.2.3.5 黏度的测定

酸乳样品到达发酵终点后，冷却至4 ℃，采用PV-Ⅱ黏度仪测定酸乳样品的黏度。

1.2.3.6 持水力的测定

参照参考文献[11]的研究方法。取12 g酸乳样品于15 mL离心管中，记录质量M1，2 000 r/min离心20 min，去除上清液，记录质量M2，按公式(2)计算样品持水力：

(2)

1.2.3.7 挥发性风味物质测定

分析采用SPME-GC-MS联用技术参照参考文献[12]测定酸乳发酵贮藏前后挥发性风味物质，取10 mL 酸乳样品于15 mL气相瓶中置于4 ℃冷藏备用。

(1)色谱条件：载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样，进样口温度250 ℃。程序升温方式，起始温度为35 ℃，保持5 min后以5 ℃/min的速率上升至140 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率上升至250 ℃，保持3 min。

(2)质谱条件：全扫描模式，EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度为230 ℃，质量扫描范围(m/z)：35～500 amu，无溶剂延迟。

(3)SPME萃取条件：萃取头老化：于250 ℃进样口老化30～60 min；固相微萃取条件：50 ℃磁力搅拌器上吸附60 min；解吸附条件：250 ℃条件下解吸附3 min。

(4)定性与定量分析：利用随机携带Masshunter工作站NIST 2.2标准库自动检索各组分质谱数据，利用面积归一化法计算各组分相对峰面积比(即每种风味物质组分峰面积占离子色谱图中所有风味物质总峰面积的百分比)。

1.2.3.8 感官评价

表1为酸乳感官评价标准。挑选10名接受过专业感官分析培训的学生组成评价组，分别对发酵酸乳进行感官评价。

表1 酸乳感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of yoghurt

1.2.4 数据分析

试验数据重复测定3次，以Mean±SD表示，采用Origin 2018软件处理作图，并采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。P<0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 酸乳酸化曲线的测定

图1为单菌株和组合菌株发酵过程中pH的变化。单菌株发酵时，嗜热链球菌HST-6和HST-9发酵速率显著高于德氏乳杆菌保加利亚亚种KDB-1，将嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种进行组合发酵的过程中，发现其组合在pH到4.6时的发酵速率较德氏乳杆菌保加利亚亚种单菌株发酵提高了近30%，这可能是由于发酵过程中嗜热链球菌是主要的产酸菌株[13]。同时，组合菌株的发酵速率高于单菌株的发酵速率。这是由于嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种共发酵时存在协同作用，在发酵过程中德氏乳杆菌保加利亚亚种产生的多肽和游离氨基酸能够进一步提高嗜热链球菌的生长繁殖以及产酸的能力[2]。

图1 单菌株和组合菌株发酵过程中pH的变化Fig.1 Changes of pH during fermentation from single strains and combined strains

2.2 酸乳发酵时间的确定

表2为单菌株和组合菌株酸乳发酵时间的测定结果。发酵时间是衡量优良酸乳发酵剂的一个重要指标，发酵时间过长可能会受到其他微生物的污染，同时在实际工业化生产过程中会造成生产成本的增加，降低效率，直接影响工厂实际经济利益。单菌株和组合菌株发酵时间均在4.13～7.45 h，其中德氏乳杆菌保加利亚亚种KDB-1发酵时间为7.45 h，显著高于其他菌株(P<0.05)，与嗜热链球菌组合发酵可显著缩短发酵时间，组合菌株发酵完成时酸度均>80 °T，显著高于单菌株发酵时的酸度(P<0.05)。

表2 单菌株和组合菌株酸乳发酵时间的确定Table 2 Determination of fermentation time of yoghurt from single and combined strains

2.3 酸乳的贮藏稳定性测定

2.3.1 贮藏期间酸乳活菌数的测定

图2为贮藏期间酸乳活菌数的测定结果。研究者认为活菌数>106CFU/mL就可以达到益生的效果[14]。贮藏14 d，单菌株和组合菌株均在108CFU/mL左右，呈一定上升趋势，其中，组合3发酵酸乳的活菌数显著高于其他菌株(P<0.05)，贮藏14 d后达到了10.25×108CFU/mL，这验证了嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种共发酵时存在协同作用，德氏乳杆菌保加利亚亚种活菌数显著低于其他菌株(P<0.05)，但贮藏期间活菌数上升最多，提高了5.13×108CFU/mL。

图2 贮藏期间酸乳活菌数的测定Fig.2 Determination of the viable counts of yoghurt during storage 注：标注小写字母表示不同样品同一天之间的差异，大写字母 表示同一样品不同贮藏天数之间的差异(P<0.05)(下同)

2.3.2 贮藏期间酸乳酸度的测定

图3为贮藏期间酸乳酸度的测定结果。众所周知，菌株的产酸能力和其耐酸性不仅直接影响酸乳的风味和组织状态，还会对酸乳中乳酸菌的活菌数产生影响，例如，酸化能力较强的菌株会导致酸乳过度酸化影响口感，酸化能力较弱会影响酸乳中风味物质的产生[15]。有研究表明，消费者能够接受的酸乳酸度为70～110 °T[16]。不同菌株发酵的酸乳4 ℃贮藏期间酸度随着贮藏期的延长而升高，除贮藏0 d时菌株KDB-1的酸度低于70 °T，其他菌株贮藏14 d期间酸乳的酸度均处于70～110 °T，处于消费者对风味接受度的范围内。贮藏14 d后，菌株KDB-1发酵的酸乳酸度显著增加，提高了24.62 °T，复合发酵时酸度上升幅度均高于单菌株HST-6和HST-9，这可能是因为酸乳在低温贮藏期间，德氏乳杆菌保加利亚亚种为主要的产酸菌株[17]；同时由于复合菌株发酵时所含的德氏乳杆菌保加利亚亚种浓度相近，因此复合菌株发酵的酸乳产酸能力基本一致。

图3 贮藏期间酸乳酸度的测定Fig.3 Determination of the acidity of yoghurt during storage

2.3.3 贮藏期间酸乳持水力的测定

图4为贮藏期间酸乳持水力的测定结果。酸乳的持水力是影响乳清析出的重要因素之一，乳清析出主要是组成发酵乳凝胶网络的颗粒在凝胶形成前和形成中的过度重排造成的[18]，它不仅受到多种流变学参数的影响，而且容易受到酸乳酸度和发酵温度的影响[19]。大部分菌株的持水力为60%～90%，具有较好的持水能力，其中组合1和组合3贮藏14 d持水力分别为98.51%、96.52%，显著高于其他菌株(P<0.05)，这表明这2种乳酸贮藏期间能保持较好的持水能力。部分菌株贮藏1 d后持水能力发生显著性变化(P<0.05)，这可能是由于4 ℃贮藏期间酸度增加，影响了酸乳的胶体结构，导致其持水力的降低。

图4 贮藏期间酸乳持水力的测定Fig.4 Determination of water-holding capacity of yoghurt during storage

2.3.4 贮藏期间酸乳黏度的测定

图5为贮藏期间酸乳黏度的测定结果。黏度是衡量酸乳品质的重要因素，酸乳黏度主要是由于酸度的不断下降而导致酪蛋白凝固，以及菌体分泌胞外多糖而使其呈现均一的黏稠状[20]。在同一发酵条件下，选择产黏性好的菌株能够改善酸乳的组织状态[21]，但黏度过高不利于工业化生产，因此综合考虑，选择黏度适中的菌株显得尤为重要。随着贮藏时间的延长，酸乳的黏度呈现先上升后下降的趋势，贮藏1 d时，黏度达到最佳，其中菌株HST-6和组合1发酵的酸乳黏度最高达到20 000 MPa·s以上，不适用于工业化生产，菌株HST-9、组合2和组合3的黏度介于6 000～10 000 MPa·s，黏度较佳，且贮藏 14 d 黏度变化较为平缓。

图5 贮藏期间酸乳黏度的测定Fig.5 Determination of the viscosity of yoghurt during storage

2.4 酸乳感官评价

图6为专业人员对酸乳的感官评价结果。感官评价是评价酸乳品质的重要指标，通过感官评价不仅能反映出酸乳样品间的差异，还能够反映出消费人群的喜好和产品的受欢迎情况。单菌株发酵的酸乳感官评分显著低于复合菌株发酵的酸乳(P<0.05)，菌株HST-6和菌株HST-9发酵速率较快，但发酵的酸乳黏度过高，且风味评分较低；而菌株KDB-1发酵的酸乳香味较好，但组织状态较差，黏度较低。组合3发酵的酸乳的感官评分最高，色泽呈乳白色，具有典型的酸奶滋味和气味，质地细腻均匀，酸甜黏度适中，贮藏14 d内品质稳定，无气泡且无乳清析出。

图6 专业人员对乳酸的感官评价Fig.6 Sensory evaluation of yoghurt

2.5 酸乳风味物质的分析

图7为酸乳贮藏阶段中挥发性成分总离子流图。利用SPME法对单菌株HST-6、HST-9和KDB-1以及3菌株复合发酵的酸乳贮藏1和14 d的酸乳样品进行风味物质富集，结合GC-MS对各样品的挥发性风味物质进行检测分析。

图7 酸乳贮藏阶段样品中挥发性成分总离子流图Fig.7 TIC of volatiles extracted from yoghurt samples during storage

表3为酸乳中挥发性风味物质的测定结果。酸乳制品都有其独特的风味特性，这主要取决于所含的特征风味物质种类和含量[22]。风味物质的数量和种类与菌株分解代谢蛋白质、脂肪、乳糖的能力有关[23]。这些代谢产物对酸乳的风味及质地的形成有着重要的作用。通过GC-MS分析，共鉴定出108种挥发性化合物，主要分为7类，主要包括醛类、酮类、酸类、酯类、醇类、芳香族、烷烃类等化合物，从风味物质种类上来看，其中脂类、酮类、酸类、烷烃类化合物相对含量较高，为其主要风味物质，其他化合物相对含量较低。贮藏14 d后，脂类、酮类、醇类、烷烃类和酸类相对含量变化显著，其中醇类，烷烃类化合物相对含量均显著降低，HST-6、HST-9、KDB-1和组合3发酵的酸乳醇类化合物分别从7.74%、7.19%、16.30%、12.93%降至3.88%、1.72%、5.25%、2.09%，烷烃类化合物从11.41%、31.53%、9.27%、14.28%降至6.28%、9.67%、7.63%、9.67%。

表3 酸乳中挥发性风味物质的测定 单位：%

表4为酸乳中主要挥发性风味物质种类及相对含量的结果。HST-6、HST-9、KDB-1和组合3发酵的酸乳分别鉴定出58、48、62和63种风味物质，其中相对含量较高的化合物有2-庚酮、辛酸、乙偶姻、叔十六硫醇等，为主要的风味物质。

表4 酸乳中主要挥发性风味物质种类及相对含量 单位：%

在酸乳发酵过程中产生的酸类化合物主要来源于脂肪分解、蛋白质水解等代谢途径[24]。酸类化合物在酸乳中发挥着重要作用，赋予酸乳特有的清爽风味[25]，酸乳中共检测到15种酸类化合物，主要有辛酸、己酸、月桂酸和醋酸等。其中正己酸能为酸乳带来香甜的干酪香气，辛酸具有清香的风味[26]，其中HST-6、HST-9、KDB-1和组合3发酵的酸乳正己酸相对含量分别为9.87%、0.00%、9.78%、0.10%，贮藏14 d后为2.71%、4.13%、9.85%、2.45%，酸乳贮藏过程中正己酸相对含量除HST-6均呈上升趋势、辛酸相对含量分别从2.44%、3.41%、2.44%、0.12%、上升到9.69%、2.45%、4.42%、3.74%。

酮类化合物多由不饱和脂肪酸的氧化、热降解或微生物代谢产生，酮类化合物能赋予酸乳特有的风味[9]。4种酸乳中均检测到了2-壬酮、2-庚酮、2，3-戊二酮、2-十一酮、乙偶姻等酮类化合物，贮藏14 d后酮类化合物相对含量显著上升，酸乳中2-壬酮、2，3-戊二酮等相对含量较高，其中HST-6、HST-9、KDB-1和组合3发酵的酸乳2-壬酮相对含量分别从0.14%、0.18%、0.29%、0.66%上升到了14 d后的4.37%、9.21%、7.61%、4.52%，2-壬酮是关键的挥发性化合物，有助于酸乳的“奶油、新鲜”风味[27]。

酯类化合物是4种酸乳中相对含量最高的一类化合物，酸乳中醇类化合物与游离氨基酸结合可以形成酯类化合物，赋予酸乳呈现迷人的香味，同时可以有效减弱脂肪酸和胺类产生的苦味[23-24]，在4种酸乳中检测到的脂类化合物相对含量较高，共检测到了38种脂类化合物，其中，甲酸庚酯、丁位癸内酯、N-羟基苯甲酸甲酯等相对含量较高。

烷烃类化合物是酸乳中重要的风味化合物之一，大多数烷烃类化合物风味阈值较高，对发酵乳风味的影响不明显，但一定浓度的烷烃类化合物可以丰富酸乳的口感[28]；酸乳中的醇类化合物可能与乳糖代谢、甲基酮还原、氨基酸代谢、亚油酸和亚麻酸降解等有关[29]，其中饱和醇的风味阈值较高，对整体风味贡献较小，不饱和醇的风味阈值较低，对风味贡献较大[30]；醛类化合物在酸乳风味化合物中占比较低，属于微量香气成分，但对酸乳风味构成有重要的影响[23]，贮藏期间4种酸乳中醛类化合物相对含量均显著上升，其中HST-9、KDB-1和组合3发酵酸乳中壬醛相对含量分别从0.49%、0.65%、0.18%上升到2.54%、1.02%和1.47%，壬醛可以赋予酸乳水果香味，提高酸乳的整体风味。

3 结论

本研究采用具有不同发酵特性的嗜热链球菌HST-6、HST-9与德氏乳杆菌保加利亚亚种KDB-1分别复合发酵，其中，菌株HST-6、HST-9与KDB-1这3种菌株复合发酵时，产酸速率最快，得到了具备3种菌株所有优良特性的酸乳，且产品酸甜适中，口感、风味优良，黏度适中，持水力强，同时贮藏期间各项指标稳定，品质最佳。通过SPME-GC-MS对单菌株及复合菌株发酵的酸乳贮藏前后的风味物质进行检测分析，共检测出108种挥发性风味物质，脂类、酮类、酸类和烷烃类含量相对较高，其中2-壬酮、2-庚酮、辛酸、乙偶姻、叔十六硫醇为主要的风味物质，贮藏14 d后，酮类化合物和脂类化合物的含量整体呈上升趋势，醇类化合物和烷烃类化合物相对含量显著降低。单菌株和复合菌株发酵的酸乳产生的挥发性化合物是不同的，包括一些已知的重要风味化合物的变化，这些风味化合物赋予不同酸乳制品特征风味。这些特征风味为生产具有特殊风味的酸乳制品的菌株选择提供依据。初步断定，菌株HST-6、HST-9与KDB-1 这3种菌株复合发酵剂可作为酸乳发酵剂进一步应用于酸乳制品生产加工过程。