血小板介导的肿瘤微环境调控：活血化瘀中药的新靶点

陶倩倩，张雷，杜晓鹂，于明星，彭丽，贺爽，朱彦*（1.天津中医药大学组分中药国家重点实验室，天津 300193；2.天津国际生物医药联合研究院中药新药研发中心，天津 300457）

近年来，肿瘤微环境已成为肿瘤治疗研究的新热点。肿瘤微环境理论是现代医学对肿瘤与其宿主之间相互关系的一种探索。1889年Paget首次提出“种子与土壤”学说，将肿瘤细胞和微环境分别比喻为种子与土壤，表明在肿瘤形成、生长的复杂过程中，微环境扮演着十分重要的作用[1]。肿瘤微环境是一个复杂的系统，由肿瘤细胞、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞、免疫细胞和炎症细胞、细胞外基质（ECM）结构成分（胶原蛋白和弹性蛋白等）和可溶性因子组成，是一个相对独立稳定的微环境[2]。与人体环境不同，肿瘤微环境具有低氧、高凝、间质高压、多种生长因子和蛋白水解酶、炎性反应以及免疫抑制等生物学特征，被认为是肿瘤增殖、侵袭、迁移、黏附及新生血管形成的重要原因。越来越多的研究表明血小板与肿瘤微环境中的各种细胞之间存在着复杂的相互作用。血小板不仅被训练和招募为肿瘤血管生成和转移的有利支持因子，而且肿瘤浸润更使血小板成为肿瘤微环境的一部分[3-4]。在肿瘤微环境中，循环血小板富含大量的细胞因子，显著增强了它们促血管生成的能力，从而促进肿瘤生长。同时，血小板和肿瘤细胞之间也存在相互作用，肿瘤细胞可诱导血小板活化（TCIPA），而活化的血小板能促进肿瘤细胞的转移，逃逸免疫系统的监视[5]。此外，肿瘤微环境的高渗、低氧均可促使血小板活化，引起肿瘤细胞高度的侵袭性和转移性[6]。因此，利用其高度丰富和特异的表位，在肿瘤微环境中靶向活化血小板，是肿瘤靶向化疗的新途径。基于此，本文将从血小板角度综述活血化瘀中药对肿瘤微环境的潜在调节作用。

1 血小板在肿瘤微环境中的作用

1.1 血小板促进肿瘤血管生成

血管生成是肿瘤恶性进展的基本过程，对肿瘤早期转移部位的发展至关重要。肿瘤生长速度主要受血小板引导的新血管形成的影响，并且受其程度的限制。肿瘤血管生成是肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞以及从骨髓招募到肿瘤的细胞之间复杂网络的结果，这种细胞间通信是由分泌的生长因子[如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）]及其相应的受体（如Notch信号受体、整合素）连接起来的[7]。血小板是血细胞中最大的血管生成调节器储存库，丰富的血小板（数量和质量仅次于红细胞）及其快速周转保证了血管生成调节剂向其靶细胞或组织的供应，因此血小板作为循环血管相关因子生成的重要来源，可以调节肿瘤血管生成和血管完整性[8-9]。血小板运输和释放的VEGF是肿瘤血管生成中最重要的蛋白之一，同时血小板α致密颗粒也可以释放直接或间接影响血管生成的蛋白质、脂质、生长因子、细胞因子和蛋白酶。血小板可以通过内吞作用主动吸收这些因子并将其分离，或者由巨核细胞选择性地将mRNA或蛋白质的子集转移到血小板[10]。在肿瘤微环境中有多种信号通路激活血小板促血管生成，如血管生成调节因子和肿瘤衍生的细胞因子隔离，血小板会根据特定的刺激因素诱导VEGF释放，如可通过二磷酸腺苷（ADP）刺激释放VEGF[11-12]。此外，血小板也可通过释放趋化因子12（CXCL12）招募造血祖细胞诱导血管重建。除了调节血管生成，血小板持续释放血管生成调节因子可稳定肿瘤血管，从而防止肿瘤内出血，维持肿瘤生长。其中维持血管完整性可能是由于分泌了含有血管生成素1（ANGPT1）和5-羟色胺（5-HT）的颗粒，这些颗粒通过对抗肿瘤细胞衍生的VEGF稳定肿瘤血管。血小板还可以通过调节血管完整性抑制免疫细胞的肿瘤浸润从而控制细胞因子的释放来减少肿瘤组织损伤[13]。

1.2 血小板促进肿瘤细胞的转移

在肿瘤的发展过程中，原发病灶中的肿瘤细胞产生其祖细胞，开始转移扩散和定植，促使微环境中肿瘤细胞的转移。在临床上90%以上的癌症患者死于肿瘤转移[14]。而血小板在早期转移微环境的细胞和非细胞成分的形成中起着重要作用，血小板可通过多种机制促进血液中肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞从原发部位分离开始转移的前提条件是在血液循环中存活下来。而肿瘤细胞结合的血小板可在肿瘤细胞周围形成一层“外衣”，帮助肿瘤细胞逃避循环中的免疫监视，并保护它们免受自然杀伤细胞（NK）的溶解，从而提高肿瘤细胞在循环中的存活率[15]。P-选择素在活化血小板和内皮细胞表面表达，是一种重要的黏附分子，对肿瘤细胞“外衣”的形成很重要，P-选择素配体和组织因子等黏附分子可在循环肿瘤细胞表面高表达，活化的血小板分泌P-选择素和肿瘤细胞P-选择素配体相互作用，介导血小板和循环肿瘤细胞形成聚集体，防止剪切力引起的肿瘤膜损伤，进而促进肿瘤细胞的转移[16]。血小板αⅡbβ3整合素与肿瘤αVβ3整合素通过肿瘤细胞组织因子介导的外源性途径形成的纤维蛋白连接；临床试验证明基因消除、阻断血小板或肿瘤细胞上的β3整合素可显著减少肿瘤转移[17]。同时，血小板可通过α颗粒释放生长因子以及金属蛋白酶，它们有助于细胞外基质的降解和肿瘤转移生态位的建立，且血小板在与肿瘤细胞接触时可分泌趋化因子5（CXCL5）和趋化因子7（CXCL7），进一步向肿瘤细胞招募单核细胞，进而增强肿瘤细胞转移[18]。此外，血小板/肿瘤细胞接触和血小板衍生的转化生长因子（TGF-β）可协同激活肿瘤细胞TGF-β/Smad和NF-κB途径，促进肿瘤细胞外渗和体内播散，诱导肿瘤细胞转变为更具侵袭性的前转移表型[19]。

1.3 血小板介导肿瘤细胞逃逸免疫系统的监视

在循环系统中，血小板包裹在肿瘤细胞表面，帮助肿瘤细胞逃避循环中的免疫监视，并保护它们免受NK细胞和T淋巴细胞的作用，从而促进其转移。血小板源性TGF-β和PDGF均能抑制NK细胞效应器功能。活化血小板分泌的TGF-β通过下调NK细胞上激活的免疫受体NKG2D，减少NK颗粒动员、细胞毒性和干扰素-γ分泌，促进各种肿瘤细胞系的上皮-间充质转化（EMT），从而促进肿瘤转移。PDGF也可减少NK与靶细胞的相互作用以及NK细胞的细胞毒性[20-21]。同时，血小板对T淋巴细胞的作用也不容忽视。富含TGF-β的血小板裂解物可在体外诱导调节性T淋巴细胞（Treg）关闭T淋巴细胞反应，使肿瘤细胞逃避T淋巴细胞介导的免疫[22]。此外，血小板包裹的肿瘤细胞表现出血小板标志物和血小板主要组织相容性的共同表达复合物（MHC）Ⅰ类转移到肿瘤细胞表面，也可使它们避开T淋巴细胞和NK细胞的作用[23]。

1.4 血小板引起肿瘤微环境的高凝、低氧状态

在肿瘤微环境中，肿瘤细胞可诱导血小板活化，影响血小板的RNA谱、循环血小板的数量以及活化状态。血小板在活化后其黏附、聚集、释放及代谢能力都会明显增强，使大量血小板聚集，激活凝血系统，引起肿瘤微环境的高凝状态。同时，在临床上恶性肿瘤患者血小板增多是引起凝血异常、弥散性血管内凝血（DIC）和并发血栓的根本原因[24]。此外，缺氧也是肿瘤微环境的特征之一，缺氧诱导因子（HIF-1）激活而引起微环境缺氧。实验数据表明HIF-1不仅被缺氧激活，而且还被血小板相关血栓性因子激活[25]。活化的血小板可释放多种介质，如PDGF、胰岛素样生长因子IGF，在HIF-1表达中也发挥作用[26]。此外，VEGF经常产生高渗透性和渗漏性血管，这可能会加重肿瘤微环境的缺氧（见图1）[27-28]。

图1 肿瘤微环境中血小板介导的肿瘤血管生成、转移以及免疫逃逸过程[27-28]Fig 1 Platelet-mediated tumor angiogenesis，metastasis，and immune escape process in the tumor microenvironment[27-28]

2 血小板与肿瘤微环境互作的现代网络药理学分析

以“platelet activation”和“tumor microenvironment”为关键词，在IPA（Ingenuity Pathway Analysis，http：//www.ingenuity.com/），NCBI-gene（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/），GeneCards（http：//www.genecards.org/）等数据库中进行搜索，整合获得该疾病相关的靶标，其中，肿瘤微环境作用靶标为674个、血小板活化作用靶标为174个（见图2A）。

采用IPA“Path Explorer”功能模块，对上述整合的数据库进行分析，寻找血小板和肿瘤微环境之间作用的共同靶点。对共同靶点进行“Core analysis”核心分析并通过“Canonical Pathways”模块按照代表通路相关性的P-value值获得top机制通路排名。通过整合两者相关靶点数据库分析发现，血小板活化和肿瘤微环境作用的公共靶点为53个（见图2B），主要为VEGF、PDGFA、PDGFB、PDGFRA、血栓烷A2受体（TBXA2R），基质金属蛋白酶MMP1、MMP2，趋化因子CX3CL1、CLCX12、CXCL8X、CCL11、CCL22、CCL5，白介素IL-6、IL-17α，NF-κB及Toll样受体4（TLR4）等靶点。通过对两者的公共靶点进行核心分析发现其作用机制通路主要与肿瘤组织因子、肝纤维化机制通路有关（见图2C）。其中在通路中排名第三位的为肿瘤微环境相关通路，这揭示着血小板与肿瘤微环境的密切关系以及其在肿瘤微环境中的重要意义，血小板可以调控肿瘤微环境的相关作用，提示可以通过靶向血小板调控肿瘤微环境。

图2 血小板活化与肿瘤微环境互作靶点分析Fig 2 Target interaction between platelet activation and tumor microenvironment

近年来，许多研究都在阐明肿瘤微环境中血小板的相关作用，对血小板如何促进微环境中肿瘤血管生成、肿瘤转移、免疫逃避、肿瘤细胞侵袭，产生了相当多的见解，而这些研究也确定了靶向肿瘤微环境的抗肿瘤治疗的潜在新药靶点。开发靶向血小板抗肿瘤药物，并利用血小板作为抗肿瘤药物的载体，可以降低肿瘤的发生、发展。因此，活化血小板靶向载体的研制可能是抗肿瘤治疗的一个新途径。

3 活血化瘀中药以血小板为靶标对肿瘤微环境的调节作用

中药具有多靶点、多成分的特点，在现有针对微环境的西药手段匮乏的条件下，中药以整体观念、辨证论治的思路，对肿瘤的治疗采取多靶点、整体调节的方法，在肿瘤的防治中发挥着越来越重要的作用。

活血化瘀是中医临床治疗肿瘤的常用治则。药理实验证明活血化瘀中药对血小板有较大影响，其可通过抑制血小板黏附、聚集以及血小板的释放影响血小板的代谢过程，血小板内的信号转导及相关差异蛋白的表达[29-32]。大量研究发现活血化瘀中药能够抑制血小板释放肿瘤血管生成的相关因子来影响肿瘤血管生成以及血管完整性[29-30]。同时也能够抑制肿瘤诱导的血小板聚集从而降低肿瘤细胞在血液循环中的存活率，抑制肿瘤细胞的增殖和转移。在肿瘤微环境中，活血化瘀中药也可通过抑制血小板活性、改善血液流变性，降低血液黏度，从而改善肿瘤微环境的高凝状态[31-32]。而近年来的研究中也发现了大量以血小板为靶标的活血化瘀药应用于肿瘤防治，也不断地阐明了以血小板为靶标的活血化瘀中药在抗肿瘤治疗上的新机制。

3.1 活血化瘀中药可抑制肿瘤血管生成

肿瘤微环境中新生血管形成是肿瘤赖以生长与转移的关键环节之一，肿瘤侵袭微生态系统（TIMES）中微血管网络、淋巴系统、免疫细胞[尤其是树突状细胞（DC）、杀伤性T淋巴细胞]与肿瘤细胞间形成了相对独立的微环境[33]。其中促新生血管形成因子与抑制因子之间的失衡，导致肿瘤新生血管形成。而血小板运输和释放的VEGF是肿瘤血管生成中最重要的蛋白之一，血小板作为微环境中循环血管相关因子生成的重要来源，可以调节肿瘤血管生成以及血管完整性，因此，靶向微环境中血小板的释放反应可阻断肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤转移。活血化瘀中药可通过抑制血小板活性从而干扰血管生成因子的释放或阻断其生成因子的作用达到抗肿瘤血管生成的目的。研究表明，活血化瘀复方瘀毒清通过降低小鼠肿瘤VEGF、MMP-2蛋白表达抑制肿瘤血管生成[34]。红花中提取的羟基红花黄色素A能使鸡胚尿囊膜（CAM）血管数明显变细且减少，还能显著抑制CAM组织中碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、VEGF及VEGF2R（flt21）的mRNA表达抑制CAM新生血管生成[35]。活血化瘀中药姜黄可通过抑制VEGF及VEGF受体，调节VEGF-VEGFR2、NF-κB的表达从而抑制肿瘤新生血管的生成[36]。

3.2 活血化瘀中药抑制肿瘤细胞转移

研究表明，活血化瘀中药通过抗凝血与抗血小板集聚作用而发挥抗肿瘤转移作用，其对肿瘤细胞与血小板的黏附具有明显的抑制作用，可阻断肿瘤细胞与血小板的黏附，减少肿瘤转移的可能性。其中榄香烯具有抗血栓和活血化瘀作用，可抑制血小板聚集，抵抗血小板黏附，降低全血黏度，抑制ADP、凝血酶和花生四烯酸诱导的血小板聚集及抑制凝血酶诱导的血小板TXA2释放，从而抑制血小板-肿瘤细胞栓子的形成，继而抑制肿瘤的转移[37]。川芎的有效成分川芎嗪能显著抑制BL-16黑色素瘤的人工肺转移，这可能是通过降低动物血浆TXB2含量，改善实验动物高黏滞血症而发挥作用的[38]。丹参有效成分的隐丹参酮可明显降低荷瘤小鼠的血小板聚集活性、改善血液黏度，从而实现其抗肿瘤血行转移的作用[39]。以肿瘤细胞-血小板聚集为基本检测指标，体外筛选可能防治肿瘤血行转移的活血化瘀中药，发现鸡血藤能显著抑制肿瘤细胞-血小板聚集作用[40]。

3.3 活血化瘀中药改善肿瘤微环境高凝状态

肿瘤的生长常常伴有血液黏度增高、外周血循环障碍，这种高凝环境很容易引起肿瘤体积的增大，肿瘤血管增生，形成瘤栓，使得包裹在增生组织中的肿瘤细胞接触药物的面积减少从而逃逸宿主免疫系统的调控；另一方面也有利于增大的肿瘤组织着床，增加了其稳定性。活血化瘀类中药有增加血管活性的功效，其加速凝血酶的失活，抑制血小板的黏附聚集，刺激血管内皮细胞释放抗凝物质和纤溶物质从而改善肿瘤组织局部的高凝状态[41]。川芎嗪注射液能够使恶性肿瘤患者血小板数量、肿瘤平均体积下降，高切变率下全血黏度降低，血浆6-酮前列腺素F1α（6-K-PGF1α）浓度增加，提示川芎嗪注射液能通过影响血小板功能而改善肿瘤微环境血液高凝状态[42]。丹参中的有效成分丹参酮ⅡA可以抑制细胞间的黏附分子，抑制血小板的黏附聚集以防止瘤栓的形成而导致的肿瘤微环境的高凝状态[43]。三七根和花总皂苷对人乳腺癌细胞诱导的血小板聚集能力也有一定的抑制作用，而且随着其浓度的增高抑制的能力更加显著[44]。此外，活血化瘀代表性药物当归、赤芍等，都可以通过抑制血小板活化，改善肿瘤微环境的高凝状态，进而对血行转移的肿瘤细胞具有很好的直接或间接抑杀作用[45]。

综上所述，活血化瘀类中药在调节肿瘤微环境的过程中起着重要的作用，其可通过抑制血小板活性调控肿瘤新生血管的生成，改善血液的高凝状态，降低微环境中有利于肿瘤生长和侵袭物质的浓度，继而抑制肿瘤细胞的生长与转移，从而达到抗肿瘤作用（见表1）。

表1 中药复方和单体潜在调控血小板/肿瘤微环境相互作用靶点Tab 1 Potentially regulate platelet/tumor microenvironment interaction targets of Chinese herbal compound and monomers

4 展望

本实验室近年来致力于活血化瘀中药靶向血小板介导的心血管相关疾病研究，阐明了一系列活血化瘀中药复方及单体的抗血小板活化作用[52-54]；此外，在肿瘤的发生发展过程中发现部分活血化瘀中药可通过靶向血小板或血管新生相关通路从而达到抗肿瘤作用[55]。

血小板在肿瘤微环境中起到重要作用，其在肿瘤血管生成、肿瘤生长和转移以及促凝血活性方面具有重要意义，这使得血小板成为近年来防治肿瘤发生发展的潜在治疗靶点。而活血化瘀中药可通过抑制血小板活性对肿瘤的血管生成、转移产生抑制作用，并改善肿瘤微环境的高凝状态，在临床运用活血化瘀中药治疗肿瘤也取得了显著疗效。活血化瘀类中药能改善肿瘤局部微环境，相比于直接作用于肿瘤细胞本身效果更好，不仅避免了肿瘤细胞本身的异质性以及培养出耐药性肿瘤细胞，还能从宏观的角度调控肿瘤的发生发展。

此外，中医治疗疾病遵循辨证论治和整体观的基本原则，肿瘤发生的病机复杂，导致肿瘤转移因素也很多，如正气亏虚、痰瘀互结、肝郁不舒等，血瘀证并非单独存在。所以，治疗上应在活血化瘀基础上与扶正祛邪、清热解毒、益气养阴等法有机结合起来，从而发挥更好的抗肿瘤效果。对于气血双亏型胃癌患者，其血小板数量和聚集性下降，纤维蛋白含量及凝血功能降低，纤溶增强。过多地应用活血化瘀中药会更加削弱血小板对血管内皮的营养作用，使抵御肿瘤细胞侵入及穿出血管的内皮细胞和基底膜完整性破坏且不易被修复，从而使肿瘤更加容易转移。同时，为避免有些活血化瘀药对机体免疫功能的抑制，活血化瘀中药应与扶正固本中药相伍而用，以抵消其不良反应。活血化瘀药的应用贵在辨证用药，虽然中医认为瘀为肿瘤病理基础之一，但它不包括全部，有是证则用是药。充分发挥中医辨证论治的优势，通过复方配伍趋利避害，更有利于活血化瘀药发挥防治肿瘤的作用。