基于外观性状及内在成分的龙胆药材等级划分

吴晓燕，翁丽丽，宿莹，刘战，姜雨昕，孙金，李翟，侯晓琳（长春中医药大学药学院，长春 130117）

龙胆始载于《神农本草经》，列为中品，为龙胆科植物龙胆（Gentiana scabraBge.）、条叶龙胆（G.manshuricaKitag.）、三花龙胆（G.triflorapall.）或滇龙胆（G.rigescensFranch.）的干燥根及根茎[1]。龙胆为传统常用大宗药材，性味苦、寒；归肝、胆经；主要化学成分为环烯醚萜类化合物，具有清火燥湿、泻肝胆火、清热健胃等作用；临床上主要应用于治疗湿热黄疸、带下、湿疹瘙痒、肝火目赤、耳鸣耳聋等症状[2-3]。龙胆主产于黑龙江、吉林、辽宁等地，国内外市场对龙胆的需求量呈逐年上升趋势，药用资源开发潜力巨大。

中药材等级不仅是评价药材质量的重要依据，也是影响药材价格高低的主要因素。中药商品规格代表了人们对中药品质的一种认识，且其品质与临床发挥的疗效密切相关，是近几年中药研究领域中的热点问题[4-6]。目前市场上流通的龙胆药材主要来源于龙胆科龙胆的干燥根及根茎，野生龙胆资源很少，多为人工栽培龙胆，故本研究所用龙胆均为人工栽培龙胆科龙胆的干燥根及根茎。关于龙胆等级划分，目前使用最多的是1984年颁布的《七十六种药材商品规格标准》[7]，距今已有30多年，参考指标较少、等级划分不明确。当前市面上，存在将龙胆药材及饮片不分等级全部混合统装现象，难以实现优质优价。2020年版《中国药典》一部中规定以龙胆苦苷为评价药材质量的指标性成分，由于不同产地龙胆品质各有差异，其他成分含量也不尽相同，以单一成分作为指标并不能全面反映药材质量。因此，本研究利用现代分析技术及统计学方法，在传统外观性状指标基础上，增加色度指标，并加入体现龙胆内在成分的指标——水溶性浸出物、龙胆苦苷、马钱苷酸和獐牙菜苦苷进行等级标准研究，为初步制订龙胆药材等级标准提供更加全面的划分依据。

1 材料

1.1 仪器

Prominence-ILC-2030型高效液相色谱仪（岛津企业管理中国有限公司）；NH300型电脑色差仪（深圳三恩驰科技有限公司）；FA1004B型万分之一电子天平（上海佑科仪器仪表有限公司）；KQ3200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；JA2603B型千分之一电子天平（上海天美天平仪器有限公司）；Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）（长春弘扬科技有限公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher Chemical），磷酸（色谱纯，天津市光复精细化工研究所），水为超纯水。龙胆苦苷对照品（批号：110770-201716，纯度：97.6%）、马钱苷酸对照品（批号：111865-201704，纯度：97.4%）、獐牙菜苦苷对照品（批号：110785-201404，纯度：98.3%）（中国食品药品检定研究院）。

45批龙胆药材由吉林省北药药材加工有限公司收集，分别产自黑龙江大兴安岭（编号L01～L21）、黑龙江小兴安岭（编号L22～L30）、吉林省抚松县（编号L31～L40）、辽宁省清源满族自治县（编号L41～L45），经长春中医药大学翁丽丽教授鉴定，均为龙胆科植物龙胆（Gentiana scabra）的干燥根及根茎。

2 方法与结果

2.1 药材长度、须根数、直径、粉末色度测量

45批龙胆药材样品，每批随机选取5根完整的药材，采用游标卡尺测量根茎至根末端的长度，取平均值；数须根数，取平均值；采用游标卡尺测量根上（根茎）、中（簇生根中部）、下（簇生根尾部）3部分直径，取平均值。粉末色度测定条件为：可选光源为D65，8度视场，4 mm测定孔径，LED 蓝光激发，仪器误差：△E*ab≤0.4。取龙胆样品（过四号筛），按照以上色度测定条件进行样品颜色测定，对仪器进行黑白板校正以后，测定L*，a*，b*值，每个样品重复测定3次，计算每份样品的平均总色差值，总色差值（E*ab）＝（L*2＋a*2＋b*2）1/2。药材外观性状具体测量结果见表1。

表1 龙胆药材外观性状测定结果Tab 1 Determination of appearance characteristics of Gentiana

2.2 水溶性浸出物

照2020年版《中国药典》四部通则2201项下的热浸法测定45批龙胆药材水溶性浸出物，结果见表2。

2.3 龙胆苦苷含量测定

照2020年版《中国药典》一部龙胆含量测定项下规定的龙胆苦苷的含量测定方法，对45批龙胆药材用高效液相色谱仪测定，高效液相色谱图见图1，测定结果见表2。

2.4 马钱苷酸、獐牙菜苦苷含量测定

2.4.1 色谱条件 依利特Hypersil ODS2 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），检测波长：240 nm；柱温：30℃；进样体积：10 μL；流速：1.0 mL·min－1；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B），梯度洗脱（0～33 min，5%→7%A；33～40 min，7%→8%A；40～50 min，8%→95%A；50～60 min，95%→5%A）。

2.4.2 混合对照品溶液的制备 取马钱苷酸、獐牙菜苦苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含马钱苷酸0.10 mg、獐牙菜苦苷0.05 mg的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过四号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系考察 按“2.4.2”项下方法制备不同质量浓度的系列混合对照品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，mg·mL－1）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归。马钱苷酸的回归方程为y＝3.62×105x＋3.75×104，r＝0.9998；獐牙菜苦苷回归方程为y＝1.04×105x－1.94×103，r＝0.9999，两成分在各自的质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

2.4.5 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积积分值，结果马钱苷酸对照品峰面积积分值RSD值为0.80%，獐牙菜苦苷对照品RSD值为0.83%。表明方法精密度良好。

2.4.6 重复性试验 精密称取同一批样品共6份，按“2.4.3”项下方法处理后进样测定。结果马钱苷酸峰面积积分值RSD值为1.6%，獐牙菜苦苷峰面积积分值RSD值为1.5%，表明方法重现性良好。

2.4.7 稳定性试验 精密称取供试品，按“2.4.3”项下方法制备成供试品溶液，分别于室温下放置0、2、4、6、8、10、12、24 h，进样测定，记录峰面积积分值。结果马钱苷酸峰面积积分值RSD值为0.70%，獐牙菜苦苷对照品峰面积积分值RSD值为0.61%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

2.4.8 加样回收试验 称取已知含量的样品共6份，分别精密加入对照品适量，依法测定，计算回收率。结果马钱苷酸平均回收率为100.3%，RSD值为0.40%；獐牙菜苦苷平均回收率为100.1%，RSD值为0.78%。表明方法准确度良好。

2.4.9 样品含量测定 取45批龙胆药材，按“2.4.3”项下方法制备成供试品溶液，分别进样10 μL，记录马钱苷酸、獐牙菜苦苷的峰面积，计算样品中马钱苷酸、獐牙菜苦苷的含量，高效液相色谱图见图2，测定结果见表2。

表2 龙胆浸出物、龙胆苦苷、马钱苷酸和獐牙菜苦苷测定结果Tab 2 Determination of extract，gentiopicrin，marcinoside and swertiamain

图2 对照品（A）及供试品（B）色谱图Fig 2 HPLC chromatogram of control（A）and sample（B）

2.5 药材外观性状与内在成分的相关性分析

采用SPSS 21.0软件对45批龙胆药材长度、须根数、直径、色度、浸出物、龙胆苦苷、马钱苷酸及獐牙菜苦苷含量进行Pearson相关性分析，结果见表3。龙胆的内在成分水溶性浸出物、龙胆苦苷、马钱苷酸及獐牙菜苦苷含量与外观性状药材长度、须根数、直径及总色差值成显著正相关，龙胆药材长度越长、须根数越多、直径越粗、颜色越浅，龙胆的内在成分（包括浸出物、龙胆苦苷、马钱苷酸和獐牙菜苦苷）的含量越高。

表3 Pearson相关性分析结果Tab 3 Pearson correlation analysis

2.6 药材质量等级划分

根据外观性状及内在成分含量多个指标的相关性，采用SPSS 21.0软件，以药材长度、须根数、直径、总色差值、浸出物、龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苦苷的含量作为分级指标变量进行K-均值聚类分析，最终聚类中心值见表4，45批药材样品可划分为两个等级，结果见图3，L01～L14、L16、L22～L34、L41为一等；L15、L17～L23、L35～L40、L42～L45为二等，以最终聚类中心值作参考，制订龙胆药材等级划分标准，见表5。

表4 K-均值聚类分析的最终聚类中心值Tab 4 Final cluster center value of K-mean cluster analysis

表5 龙胆药材质量等级划分Tab 5 Quality classification of Gentiana

图3 K-均值聚类分析树状图Fig 3 Tree diagram of K-means cluster analysis

3 讨论

中药的性状判定是传统质量评价主要形式，但传统性状评价具有很大的主观性。近年来，色差仪在中药材颜色的量化检测中受到广泛应用[7-10]。本研究采用色差仪测量龙胆药材粉末色度，比肉眼观察颜色深浅更为精准。吴翠[11]研究发现，5-羟甲基糠醛普遍存在于中药中，其含量与药材的色泽、年份存在相关性，一些药材贮存时间越久，贮存或加工温度越高，5-羟甲基糠醛的含量越高，药材颜色也越深，有效成分也就越低。本研究表明，龙胆药材颜色越深，其龙胆苦苷等有效成分含量越低，由此猜测，这可能与其采收加工或贮存时间、贮存时的温度有关，后续研究可以考虑增加5-羟甲基糠醛的测定验证这一猜想。

根及根茎类药材在植物药中所占比例大，在中药中占有举足轻重的地位。该类药材传统上主要按照基原、产地、部位、采收加工方法等划分规格，并主要以可以方便掌握的性状作为划分依据[12-14]。中药成分的复杂多样决定了单一成分的含量不能全面反映药材质量，必须采用多成分、多指标进行综合质量分析[15]。本研究在对龙胆质量进行传统研究的基础上，增加了内外指标的联系，通过K-均值聚类分析初步划定了较明确的等级范围，制订的标准从外在品质到内在品质均更加全面、具体，对龙胆药材等级划分及规范性贮存等具有积极意义，也为其他根及根茎类中药的等级划分提供了很好的思路。后期可以增大样品量及样品产地来源，以期利用现代先进科技手段，尽最大可能地保障和控制龙胆的质量，从而筛选优良龙胆药材资源，更好地实现药材的优质优价。