UPLC-MS/MS法同时测定灵源万应茶中有机酸成分的含量

吴文理，黄保驾，陈天乙，李煌（.厦门市中医院，福建 厦门 6009；.晋江梅岭街道社区卫生服务中心，福建 泉州 600；.厦门市儿童医院，福建 厦门 6006；4.福建中医药大学药学院，福州 50）

灵源万应茶为养生药茶，可疏风解表、祛暑化湿，是闽南一带及东南亚地区常用的防暑降温药茶。灵源万应茶是由木香、广藿香、鬼针草等58味中药材、红茶和麦粉加工而成。这项传统制备工艺是药饼在反复蒸晒的过程中利用环境中的微生物自然发酵，工艺独具特色。在国家药品标准中，虽然有关于灵源万应茶质量标准的要求，但原有标准中仅包含检查项，并无含量测定项。另外，该制剂的相关研究报道较少，目前也尚未见有同时定量检测灵源万应茶中多种成分的方法。此外已有研究表明，紧压茶随着发酵时间的延长，有机酸含量减少[1]。在日常饮用中发现，灵源万应茶口感有时略有差异，推测口感与其有机酸含量密切相关，因此，本研究采用了UPLCMS/MS法检测灵源万应茶中原儿茶酸、绿原酸、丁香酸、肉桂酸等9种有机酸的含量，以期为该制剂的全面质量控制提供参考。

1 仪器与试药

XS105DU型十万分之一分析天平（美国Mettler-Toledo公司）；TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；SCIEX QTRAP 4500三重四极杆质谱（美国SCIEX公司）；Nexera X2超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器公司）；甲醇、乙酸铵和甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；其余试剂为分析纯。

灵源万应茶（泉州市灵源药业有限公司，批号：190601、191002、191101，规格：15 g/块）；原儿茶酸（批号：110809-200604，纯度＞99%）、绿原酸（批号：110753-201716，纯度＞99%）对照品（中国食品药品检定研究院）；对羟基苯甲酸对照品（上海宝曼生物科技有限公司，批号：D13O8S45560，纯度＞99.1%）；咖啡酸对照品（成都曼思特生物技术有限公司，批号：MUST-17032010，纯度＞98.5%）；香草酸（批号：H11J9Z65318）、丁香酸（批号：S23F7K9842）、邻苯二甲酸（批号：AM0509LB14）、芥子酸（批号：S05M6Y）和肉桂酸（批号：AA0806LB14）对照品（纯度均＞98%，南京森贝伽生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack XR-ODSⅢ（2 mm×75 mm，1.6 μm）；流动相：0.1%甲酸5 mmol·L－1乙酸铵水溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱（0～0.5 min，35%B；0.5～3.5 min，35%B→90%B；3.5～5.0 min，90%B；5.0～5.5 min，90%B→35%B；5.5～7.0 min，35%B）；流速：0.30 mL·min－1；柱温：40℃；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源，在MRM正负离子模式下扫描，毛细管电压：4500 V，脱溶剂温度：500℃、气流：氮气800 L·h－1，锥孔气流：氮气150 L·h－1，离子源温度：550℃，二级锥孔萃取电压：3 V，碰撞气体：氩气，各成分的具体质谱分析参数如下表1所示。各成分的MRM图如图1所示。

图1 对照品（A）和供试品（B）的 UPLC-MS/MS图Fig 1 UPLC-MS/MS of the reference substances（A）and sample（B）

表1 各成分的保留时间及质谱分析参数Tab 1 Retention time and MS parameters of various constituents

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液 精密称取2.0 g灵源万应茶样品置于圆底烧瓶中，加入100 mL 60%乙醇，精密称定，加热回流2 h，冷却，60%乙醇补足重量，过滤，摇匀，取滤液定容至25 mL量瓶中，在45℃水浴下旋蒸至干，精密加入2.5 mL 50%甲醇溶液，涡旋溶解，转移到离心管中，以10 000 r·min－1离心10 min，过0.22 μm微孔滤膜，取上清液，即得供试品溶液（4℃下保存）。

2.2.2 对照品溶液 精密称取原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、邻苯二甲酸、芥子酸和肉桂酸对照品适量，加入甲醇制成质量浓度分别为1.10、1.22、1.02、1.31、1.27、1.13、1.05、1.00、1.39 mg·mL－1的单一对照品溶液；分别精密量取上述对照品溶液90.9、82.0、98.0、76.3、78.7、88.5、95.2、100.0、71.9 μL，置于10 mL量瓶内，加入20%甲醇水至刻度，可得各成分质量浓度均为10 μg·mL－1的混合对照品储备液，其他不同质量浓度的混合对照品溶液均由其逐级稀释所得。

2.3 UPLC-MS/MS方法学考察

2.3.1 线性关系考察 取“2.2.2”项下对照品储备液适量，用20%甲醇稀释，配制系列质量浓度的对照品混合溶液，进样分析。以对照品溶液质量浓度（X）为横坐标，各成分定量离子峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数（r），信噪比（S/N）＝10得定量限，结果见表2。

表2 线性方程、线性范围、相关系数及定量下限Tab 2 Regression equation，linearity and LLOQ of various constituents

2.3.2 精密度试验 取各成分质量浓度均为0.1 μg·mL－1的混合对照品溶液，连续进样6次测定，结果各有机酸成分峰面积RSD结果见表2，表明本试验所用的仪器精密度良好。

2.3.3 稳定性试验 取灵源万应茶样品，按“2.2.1”项下方法制备，分别于制备后的0、2、4、8、12、24 h进样测定。结果各有机酸成分峰面积RSD结果见表2，表明在24 h内供试品溶液相对稳定。

2.3.4 重复性试验 精密称取灵源万应茶样品6份，按“2.2.1”项下方法制备，进样测定，各成分含有量的RSD结果见表2，表明本方法重复性良好。

2.3.5 加样回收试验 精密称取6份1.0 g灵源万应茶样品，分别加入一定体积的混合对照品溶液，进行加样回收率考察。结果9种成分的平均回收率在97.4%～100.9%，RSD在1.2%～2.8%（n＝6），表明该方法准确度较高（见表3）。

表3 加样回收试验(n＝6)Tab 3 Recovery (n＝6)

2.3.6 样品含量测定 取3批灵源万应茶样品，分别精密称取2.0 g，每批各3份。按“2.2.1” 项下方法制备，按“2.1”项下条件进样分析，计算含量。在3份样品中，各成分平均含量分别为：原儿茶酸（316.0±30.2）mg·kg－1、绿原酸（551.0±69.1）mg·kg－1、对羟基苯甲酸（43.6±4.3）mg·kg－1、咖啡酸（40.9±3.8）mg·kg－1、香草酸（25.4±2.1）mg·kg－1、丁香酸（16.6±1.8）mg·kg－1、邻苯二甲酸（22.4±2.0）mg·kg－1、芥子酸（0.378±0.040）mg·kg－1、肉桂酸（20.4±1.9）mg·kg－1。

3 讨论

3.1 测定方法的选择

关于灵源万应茶的测定方法，谢敏等[2]通过薄层色谱法鉴别其中含有的木香、肉桂、积雪草和丁香4味药材，以建立其质量标准。林隽丹等[3]采用HPLC法，测定其桂皮醛的含量情况。本方由58味中药材加红茶组成，有效成分十分复杂，并且大部分药材成分含量较低，容易因为相互干扰和受杂质干扰而影响测定结果，无法较好地控制其质量。全方中药材质量≤10 g的品种高达40种，检测难度较大。近年来，UPLC-MS/MS法在中成药研究中的应用越来越多[4-6]，因此，本研究选择了UPLC-MS/MS法，并且选择MRM模式对灵源万应茶的成分进行含量测定[7]，分析周期短，能够在7 min内将9种成分完全分离，实现了灵源万应茶中9种有机酸成分含量的同时测定，节约了检测时间。

3.2 测定成分的选择

灵源万应茶组成药味众多，成分复杂，主要含有机酸类、黄酮类和皂苷类等，其中，有机酸类成分是灵源万应茶中的一大类重要成分，具有较为广泛的药理作用。绿原酸作为一种水溶性有机酸，广泛分布在植物界中，具有较强的生物活性，可抗氧化、抗菌、抗肿瘤、抗炎及抗病毒等[8]。研究发现灵源茶中绿原酸的含量最高，与其处方中多味药材如墨旱莲[9]、一点红[10]、木香、紫花地丁、叶下珠等均含有绿原酸有关。原儿茶酸具有羟基结构，因此抗氧化能力较强，甚至超过了维生素C、维生素E等[11]。对羟基苯甲酸同样也具有抗炎抑菌作用，其可能是发挥抗氧化作用的物质之一，并且对治疗肿瘤方面有潜在的间接作用[12]。考虑到灵源万应茶是养生药茶，在保证疗效的同时需要较好的口感，目前已有报道显示原儿茶酸等与茶口感相关[13]，因此本文选择了这9种有机酸作为检测指标。

3.3 色谱条件的选择

选用了不同型号、不同粒径与不同长度的色谱柱检测灵源万应茶中9种有机酸成分的分离效果，结果显示，Shim-pack XR-ODSIII（2.0 mm×75 mm，1.6 μm）色谱柱的分离度和灵敏度最佳。另外，在考察流动相对测定成分的洗脱情况时，首先选择了常用的甲醇-水和乙腈-水，结果显示乙腈洗脱能力太强，造成9种有机酸成分的体系分离效果较差，因此流动相选择了甲醇-水。再考察流动相中加入甲酸和乙酸铵，发现甲酸和乙酸铵可提高离子响应及积分准确度、改善各有机酸成分的离子峰形，结果表明，当甲酸体积分数达到0.1%、乙酸铵为5 mmol·L－1时响应良好，且峰形最佳。因此本试验的流动相最终选择了0.1%甲酸5 mmol·L－1乙酸铵水溶液-甲醇。

本试验以灵源万应茶9种有机酸成分作为研究对象，并对其进行了方法学考察，所建立的UPLC-MS/MS法准确快速，可以同时测定9种有机酸成分含量，为灵源万应茶有机酸成分的含量测定提供参考依据。