基于同步荧光光谱的鸡肉中磺胺二甲基嘧啶和氧氟沙星残留的快速检测

陈 健，刘木华，2，袁海超，2，黄双根，2，赵进辉，2*，徐 宁，王 婷，胡 围

（1.江西农业大学 工学院 江西省现代农业装备重点实验室，江西 南昌330045；2.江西农业大学 工学院 江西省果蔬采后处理关键技术及质量安全协同创新中心，江西 南昌330045）

1 引言

自1929年Fleming［1］发现第1剂抗生素（青霉素）以来，抗生素得到了快速发展和应用，不仅用于治疗人类的各类感染性疾病，而且也用于解决家禽养殖中存在的疫病防治问题。然而，在家禽养殖中使用抗生素是一把双刃剑，因为抗生素会残留在家禽中，人类食用这种家禽后抗生素会导致各种副作用，例如破坏人体的肠道菌群，转移耐药性细菌至人体和致癌等［2-4］。

磺胺二甲基嘧啶（Sulfamethazine，SM 2）属于磺胺类抗生素，氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）属于喹诺酮类抗生素，均是家禽疾病防治的常用药。为保障家禽产品质量安全和公共卫生安全，中国农业农村部规定在鸡肌肉组织中SM 2的最大残留限量为100μg/kg，禁止使用OFL［5-6］。目前，检测肉中磺胺类和喹诺酮类抗生素残留的方法主要有液相色谱法［7-8］、液相色谱和质谱联用法［9-10］等。这些方法需要实验室环境、熟练的技术人员和较长的检测时间等，难以满足日益增长的现场实时检测需求［11-13］。因此，需要开发操作简单、快速和低成本的检测技术。荧光属于光致发光现象，当紫外线照射某些物质时，这些物质会发射出不同颜色和强度的可见光，而当停止照射时，发射的光也会迅速消失［14］。在实际使用中，常规荧光光谱法具有较高灵敏度，但对于一些多组分混合物分析时，荧光光谱常重叠严重，难以分析，光谱检测效果不佳。为改善荧光检测的效果，同步荧光扫描技术被提出，该技术同时扫描激发和发射单色器波长，并将测得的荧光强度信号对应的激发（或发射）波长作图［15-16］。与常规荧光光谱相比，同步荧光法具有窄化光谱带、减弱光谱重叠等优点。科研人员已经应用同步荧光技术检测猪肉中头孢噻呋或头孢拉定残留［17-18］，由此表明同步荧光技术可用于单种抗生素残留的快速检测。

目前，应用同步荧光技术同时检测鸡肉中SM 2和OFL残留的研究尚无报道。因此，本文将同步荧光技术与化学计量学方法结合，以鸡肉为载体，SM 2和OFL为研究对象，优化了荧光检测条件，建立并对比了峰高法和峰面积法的预测模型，为进一步应用同步荧光技术检测肉中抗生素残留提供技术支持。

2 实验

2.1 材料与试剂

鸡胸肉（南昌市某大型超市）；SM 2（99.4%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；OFL（≥99%，上海源叶生物科技有限公司）；邻苯二甲醛、β-巯基乙醇（99.0%，成都艾科达化学试剂有限公司）；硼酸（≥99.5%）、磷酸（≥85.0%）（西陇科学股份有限公司）；乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA）、磷酸 二 氢 钾（KH2PO4）和 磷 酸 氢 二 钾（K2HPO4·3H2O）（分析纯，西陇科学股份有限公司）；冰乙酸（≥99.5%，天津市大茂化学试剂厂）；三氯乙酸（分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；有机相针式滤器（0.45μm，上海安谱实验科技股份有限公司）。

磷酸盐缓冲液（含0.4 mmol/L的Na2EDTA和10%的三氯乙酸溶液）的配制：准确称取1 g K2HPO4·3H2O和4 g KH2PO4，用480 mL超纯水溶解，分别加入Na2EDTA 75 mg和三氯乙酸50 g，溶解混匀并用超纯水定容至500 mL。0.01 mol/L邻苯二甲醛溶液的配制：准确称取0.134 g邻苯二甲醛溶于100 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度。0.1 mol/Lβ-巯基乙醇溶液的配制：准确量取β-巯基乙醇704μL于100 mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度。BR缓冲液（p H 1.8）的配制：用超纯水配制浓度各为0.04 mol/L的磷酸、冰乙酸和硼酸混合缓冲溶液。

2.2 仪器与设备

实验设备有：Cary Eclipse荧光分光光度计（美国瓦里安）；FA 1004B电子天平（上海上平仪器有限公司）；全自动RO纯水机（湖南科尔顿水务有限公司）；JK-50B超声波清洗器（合肥金尼克机械有限公司）；VORTEX-5漩涡混合器（海门市其林贝尔仪器有限公司）；KJ-201BS振荡器（江苏康健医疗用品有限公司）；JW-1024低速离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；JJ-2B组织捣碎匀浆机（江苏省金南仪器厂）；1 cm光程石英比色皿（宜兴市晨伟玻璃仪器厂）。

2.3 样品的制备

（1）抗生素储备液的配制：取7.5 mg的SM 2（或OFL）标准品溶于50 mL超纯水，可得到150 mg/L SM 2（或150 mg/L OFL）储备液，于4℃下储存。

（2）SM 2工作液的配制：取0.6 mL的SM 2储备液，用超纯水稀释至15 mL，得到6.0 mg/L SM 2工作液，于4℃下储存。

（3）OFL工作液的配制：取0.1 mL的OFL储备液，用超纯水稀释至15 mL，得到1.0 mg/L OFL工作液，于4℃下储存。

（4）根据文献［8］中的快速溶剂萃取法提取空白鸡肉，具体操作如下：称取均质的鸡胸肉5.0 g（精确到0.1 g），置于50 mL离心管中，加入超纯水4 mL，涡旋1 min，再加入磷酸盐缓冲液10 mL，涡旋1 min，振荡15 min，4500 r/min离心15 min，将上清液转移至另一个50 mL离心管中，往离心管沉淀物中再加入磷酸盐缓冲液10 mL；重复上述步骤1次，并将2次提取的上清液合并，混匀，过0.45μm滤膜，用磷酸盐缓冲液定容至25 mL，得到空白鸡肉提取液。

（5）根据文献［8］，鸡肉中SM 2和OFL的残留提取操作分为3部分。①混合抗生素工作液的配制：在10 mL离心管中分别加入0.083，0.167，0.500，0.750，1.000，1.250，1.500，1.750，2.250，2.500 mL的SM 2储备液和0.042，0.083，0.167，0.417，0.500，0.583，0.667，0.750，0.833，0.917 mL的OFL储备液，两者浓度随机组合，用超纯水定容至4 mL，得到这两种混合抗生素工作液。②加标鸡肉的制备：称取均质的鸡胸肉5.0 g（精确到0.1 g），置于50 mL离心管中，加入4 mL混合抗生素工作液，涡旋1 min。③鸡肉中抗生素的提取：加入磷酸盐缓冲液10 mL，涡旋1 min，振荡15 min，4500 r/min离心15 min，将上清液转移至另一个50 mL离心管中，往离心管沉淀物中再加入磷酸盐缓冲液10 mL，重复上述步骤1次，并将2次提取的上清液合并，混匀，过0.45μm有机相滤膜，用磷酸盐缓冲液定容至25 mL。得到含SM 2和OFL的鸡肉提取液：SM 2浓 度 为0.5，1.0，3.0，4.5，6.0，7.5，9.0，10.5，13.5，15.0 mg/L（分别对应于鸡肉中含有2.5，5.0，15.0，22.5，30.0，37.5，45.0，52.5，67.5，75.0 mg/kg的SM 2），OFL浓度为0.25，0.5，1.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5 mg/L（分别对应于鸡肉中含有1.25，2.5，5.0，12.5，15.0，17.5，20.0，22.5，25.0，27.5 mg/kg的OFL）。

2.4 标准溶液以及鸡肉提取液的三维同步荧光光谱的采集

为了采集标准溶液以及鸡肉提取液的三维同步荧光光谱，分别取200μL SM 2标准溶液（6.0 mg/L）、OFL标准溶液（1.0 mg/L）、空白鸡肉提取液和含SM 2和OFL的鸡肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL）于不同的石英比色皿中，再先后加入800μL BR缓冲液，100μL β-巯基乙醇溶液和100μL邻苯二甲醛溶液，采集波长差（Δλ：20～300 nm，间隔10 nm）的三维同步荧光光谱。

2.5 定性实验设计方案

（1）为了探究不同β-巯基乙醇溶液加入量对同步荧光强度的影响，向石英比色皿中依次加入200μL含SM 2和OFL的鸡肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL），BR缓冲液（调节其体积使体系恒为1.2 mL），25，100，300，400，600和800μL的β-巯基乙醇溶液，100μL邻苯二甲醛溶液，设置5个平行组，采集44 min，Δλ=150 nm和210 nm处的同步荧光光谱。

（2）为了探究不同邻苯二甲醛溶液加入量对同步荧光强度的影响，向石英比色皿中依次加入200μL含SM 2和OFL的鸡肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL），BR缓冲液（调节其体积使体系恒为1.2 mL），300μLβ-巯基乙醇溶液，25，100，200，300和400μL的邻苯二甲醛溶液，设置5个平行组，采集44 min，Δλ=150 nm和210 nm处的同步荧光光谱。

（3）为了探究不同时间对同步荧光强度的影响，向石英比色皿中依次加入200μL含SM 2和OFL的鸡肉提取液（6.0 mg/kg SM 2，1.0 mg/kg OFL），675μL BR缓冲液，300μLβ-巯基乙醇溶液，25μL邻苯二甲醛溶液，设置5个平行组，采集0～100 min（间隔4 min），Δλ=150 nm和210 nm处的同步荧光光谱。

2.6 定量实验设计方案

向石英比色皿中依次加入200μL的含不同浓度SM 2和OFL的鸡肉提取液，675μL BR缓冲液，300μLβ-巯基乙醇溶液，25μL邻苯二甲醛溶液，设置5个平行组，采集44 min，Δλ=150 nm和210 nm处的同步荧光光谱。

2.7 荧光光谱仪参数设置

标准溶液以及鸡肉提取液的三维同步荧光光谱采集时，荧光光谱仪的采集参数设置如下：激发波长的扫描范围为240～490 nm，激发、发射狭缝宽度分别为10 nm和5 nm，光电倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）电压为700 V。

定性实验和定量实验时，荧光光谱仪的参数设置如下：激发波长的扫描范围为240～400 nm，激发、发射狭缝宽度分别为10 nm和5 nm，PMT电压为700 V。

2.8 数据处理方法

在建立预测模型之前，使用The Unscram⁃bler X 10.4（挪威CAMO公司）软件对原始光谱进行基线偏移，以消除原始光谱的基线漂移。其次，使用LabSpec 5（法国JobinYvon公司）软件对SM 2的同步荧光光谱（Δλ=150 nm，激发波长在270～315 nm）和OFL的同步荧光光谱（Δλ=210 nm，激发波长在275～315 nm）进行峰面积计算。为了建立基于峰高法的预测模型，拟合鸡肉中SM 2残留浓度和荧光激发峰强度（Δλ=150 nm，荧光激发峰为292.5 nm）之间的关系、拟合鸡肉中OFL残留浓度和荧光激发峰强度（Δλ=210 nm，荧光激发峰为295 nm）之间的关系，来评估荧光激发峰强度与相应浓度之间是否存在良好的线性关系。此外，为了建立基于峰面积法的预测模型，拟合鸡肉中SM 2残留浓度和荧光激发峰面积之间的关系以及鸡肉中OFL残留浓度和荧光激发峰面积之间的关系，来评估荧光激发峰面积与相应浓度之间是否存在良好的线性关系。计算训练集决定系数（Coefficient of Determina⁃tion for the Training Set，）、预测集决定系数（Coefficient of Determination for the Prediction Set，）、预测集均方根误差（Root Mean Square Error for the Prediction Set，RMSEP）、回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），以评估预测模型性能。

3 结果与分析

3.1 标准溶液以及鸡肉提取液的三维同步荧光光谱

SM 2和OFL具有不同的荧光基团，进而有着不同的荧光特性。为了同时检测这两种抗生素，需要SM 2和OFL都能表现出明显的荧光特征，从而收集包含这两种抗生素的荧光信息。SM 2是弱荧光物质，但它具有伯胺基团，可通过衍生剂（本文使用邻苯二甲醛）进行衍生，其产物在Δλ/激发波长为150/292.5 nm处有荧光激发峰。伯胺化合物与邻苯二甲醛反应的化学方程式［19］如下：

另一方面，从化学结构来看，OFL具有共轭结构和刚性，且其核心结构部分为喹啉，因此具有较强的荧光特性［20］。图1（a）和图1（b）分别为SM 2衍生物和OFL的三维同步荧光等高线图。从中可见，OFL在Δλ/激发波长为170/330 nm和210/295 nm处有荧光激发峰。鸡肉成分复杂（存在蛋白质、脂肪等），某些成分（例如色氨酸等）具有较强的荧光特性，因此，采用三氯乙酸、有机相针式滤器对提取液进行处理，以减弱蛋白质、脂肪等物质的干扰。图1（c）为空白鸡肉提取液的三维同步荧光等高线图。从中可见，空白鸡肉提取液在Δλ/激发波长为60/282.5 nm和130/337.5 nm处有明显的荧光激发峰。图1（d）为含SM 2和OFL的鸡肉提取液的三维同步荧光等高线图。从中可见，在含SM 2和OFL的鸡肉提取液中SM 2衍生物和OFL显现出它们的荧光激发峰。综上所述，待测抗生素（SM 2、OFL）与鸡肉背景的荧光信号有明显的区别，可通过Δλ/激发波长150/292.5 nm（SM 2）和210/295 nm（OFL）实现同时检测。

图1 三维同步荧光等高线图Fig.1 Contour spectra of three-dimensional synchronous fluorescence

3.2 同步荧光光谱检测条件优化

在邻苯二甲醛与SM 2的衍生过程中，β-巯基乙醇作为还原剂［21］，其加入量会影响目标衍生物的生成量。由图2（a）可知，β-巯基乙醇溶液加入量在25～300μL内，随着β-巯基乙醇溶液加入量的增多，SM 2衍生物的荧光强度迅速增强。这可能是随着β-巯基乙醇含量增加，更多的β-巯基乙醇参与了衍生反应，SM 2衍生物产量增加了。β-巯基乙醇溶液加入量在300～800μL内，它对SM 2衍生物的荧光强度影响不大。这是因为β-巯基乙醇溶液加入量对SM 2衍生物生成的影响减小了。此外，β-巯基乙醇溶液加入量在25～600μL内，随着β-巯基乙醇溶液加入量的增多，OFL的荧光强度增强。这是因为在酸性介质（p H 4）中具有苯环的OFL荧光特性更强［22］，随着β-巯基乙醇（pH 4.5～6.0）含量的增加，体系p H逐步向β-巯基乙醇靠近。β-巯基乙醇溶液加入量在600～800μL内，它对OFL的荧光强度影响不大。这是因为β-巯基乙醇溶液加入量对体系p H的影响减小了。从图2（a）可以看出，加入β-巯基乙醇溶液300μL时，SM 2衍生物的荧光强度达到最大，且OFL的荧光强度比SM 2衍生物强。因此，β-巯基乙醇溶液的加入量在300～800μL之间。SM 2产生荧光条件苛刻，且荧光较弱，所以增强其荧光强度有利于提高检测灵敏度。综合考虑，SM 2和OFL的荧光强度以及节约β-巯基乙醇用量，确定300μL为最佳加入量。

目前，邻苯二甲醛在荧光检测中得到了广泛的应用［23-25］。由图2（b）可见，邻苯二甲醛溶液加入量在25～300μL内，随着邻苯二甲醛溶液加入量的增多，SM 2衍生物的荧光强度逐渐减弱。在异吲哚衍生物形成过程中加入过量的邻苯二甲醛会导致其快速降解［26-28］，这是SM 2衍生物荧光强度减弱的原因。邻苯二甲醛溶液加入量在300～400μL内，它对SM 2衍生物荧光强度的影响不大。这是因为邻苯二甲醛溶液加入量对异吲哚衍生物降解的影响减弱了。此外，邻苯二甲醛溶液加入量在25～300μL内，随着加入量的增多，OFL的荧光强度也逐渐减弱。在酸性体系中，随着邻苯二甲醛（pH7，53 g/L）含量的增加，体系的pH升高，从而减弱了OFL的荧光特性。邻苯二甲醛溶液加入量在300～400μL内，它对OFL荧光强度的影响不大。这是因为邻苯二甲醛溶液加入量对体系pH的影响减弱了。综合考虑，在加入邻苯二甲醛溶液25μL时，SM 2衍生物和OFL的荧光强度最强。因此，选择25μL作为邻苯二甲醛溶液的加入量。

由图2（c）可知，在0～44 min内，随着时间的增加，SM 2衍生物的荧光强度逐渐增强，在44 min后，其荧光强度保持稳定。此外，在0～30 min内，随着时间的增加，OFL的荧光强度也随之增强；在30 min后，其荧光强度保持稳定。综合考虑，在30 min时，OFL的荧光强度达到最大；在44 min时，SM 2衍生物的荧光强度达到最大，同时OFL的荧光强度并未减弱。因此，选择在44 min采集荧光光谱。

图2 不同条件对荧光强度的影响Fig.2 Effects of difference conditions on fluorescence intensity

3.3 预测模型建立及预测结果分析

含SM 2和OFL的鸡肉提取液样本共10个，采用1∶1的分配方案，预测集的数据都落在训练集的范围之内，训练集、预测集都由5个样本组成，如表1所示。预测模型的性能用预测集进行验证，拟合真实值与预测值之间的线性关系。

表1 鸡肉中SM 2和OFL残留的样本统计结果Tab.1 Statistical results of samples of SM 2 and OFL residues in chicken

3.3.1 基于峰高法的预测模型

图3（a）为鸡肉中不同浓度SM 2残留和对应的荧光激发峰强度（Δλ=150 nm，荧光激发峰为292.5 nm）之间的线性关系。由图可知，基于峰高法的SM 2残留的工作曲线具有良好的线性关系，线性方程为y=0.5505x+18.884，为0.9194。由图3（c）可知，真实值与预测值之间的为0.8973，RMSEP为6.0605 mg/kg。对预测集样本进行回收实验，样本回收率处于76.1%～115.2%之间，RSD处于2.7%～7.0%之间（见表2）。

图3 基于峰高法的鸡肉中SM 2和OFL残留的工作曲线和预测集样本关系Fig.3 Working curves and relationship between actual and predicted values of SM 2 and OFL residues in prediction sam⁃ples in chicken by peak height algorithm

图3（b）为鸡肉中不同浓度OFL残留和对应的荧光激发峰强度（Δλ=210 nm，荧光激发峰为295 nm）之间的线性关系。由图可知，基于峰高法的OFL残留的工作曲线具有良好的线性关系，线 性 方 程 为y=7.7838x+15.919，R2

T为0.9738。由图3（d）可知，真实值与预测值之间的为0.9973，RMSEP为0.5392 mg/kg。对预测集样本进行回收实验，样本回收率处于96.7%～110.1%之间，RSD处于2.8%～10.0%之间（见表2）。

表2 基于峰高法的鸡肉中SM 2和OFL残留的预测结果Tab.2 Prediction results of SM 2 and OFL residues in chicken by peak height algorithm

3.3.2 基于峰面积法的预测模型

图4（a）为鸡肉中不同SM 2残留和对应的荧光激发峰面积（Δλ=150 nm，激发波长为270～315 nm）之间的线性关系。由图可知，基于峰面积法的鸡肉中SM 2残留的工作曲线具有良好的线性关系，线性方程为y=20.508x+870.12，为0.8328。由图4（c）可知，真实值与预测值之间的R2

P为0.7281，RMSEP为11.2770 mg/kg。对预测集样本进行回收实验，回收率处于56.3%～127.4%之间，RSD处于2.5%～6.6%之间（见表3）。

对比基于峰高法和峰面积法的鸡肉中SM 2残留预测模型可知，基于峰高法的预测模型比基于峰面积法的预测模型的和大，分别大了0.0866和0.1692，表明采用峰高法可以有效地提高预测模型的线性关系，提高预测集的真实值和预测值之间的线性关系。基于峰高法的预测模型比基于峰面积法的预测模型的回收率的上、下限值更接近100%，此外，基于峰高法的预测模型比基于峰面积法的预测模型的RMSEP减小了5.2165 mg/kg，表明采用峰高法可以显著提高预测模型的准确度。基于峰高法和基于峰面积法的预测模型的RSD均小于7%，表明采用这两种算法分析数据，预测模型均具有良好的精密度。

图4（b）为鸡肉中不同OFL残留和对应的荧光激发峰面积（Δλ=210 nm，激发波长为275～315 nm）之间的线性关系。由图可知，基于峰面积法的鸡肉中OFL残留的工作曲线具有良好的线性关系，线性方程为y=238.07x+505.57，为0.9748。由图可知，真实值与预测值之间的为0.9965，RMSEP为0.6060 mg/kg。对预测集样本进行回收实验，回收率处于96.7%～113.5%之间，RSD处于2.9%～9.9%之间（见表3）。

表3 基于峰面积法的鸡肉中SM 2和OFL残留的预测结果Tab.3 Prediction results of SM 2 and OFL residues in chicken by peak area algorithm

图4 基于峰面积法的鸡肉中SM 2和OFL残留的工作曲线和预测集样本关系Fig.4 Working curves and relationship between actual and predicted values of SM 2 and OFL residues in chicken in predic⁃tion samples by peak area algorithm

对比基于峰高法和峰面积法的鸡肉中OFL残留预测模型可知，基于峰高法和基于峰面积法的预测模型的和相差很小，表明采用峰高法和峰面积法建立的预测模型都具有良好的线性关系且差异不大，此外，预测集的真实值和预测值之间也都具有良好的线性关系且差异不大。基于峰高法的预测模型比基于峰面积法的预测模型的回收率上限值要更接近100%，且预测模型的RMSEP要小0.0668 mg/kg，表明采用峰高法能够提高预测模型的准确度。基于峰高法和基于峰面积法的预测模型的RSD均小于10%，表明采用这两种方法建立的预测模型均具有良好的精度。

综上所述，本实验优选峰高法建立鸡肉中SM 2和OFL残留的预测模型，检测鸡肉中SM 2和OFL残留的检出限分别可达2.5 mg/kg和1.25 mg/kg，能够满足鸡肉中SM 2和OFL残留快速同时检测的要求。

4 结论

本文采用同步荧光技术结合化学计量学方法，提出了鸡肉中SM 2和OFL残留快速检测方法。首先，分析了SM 2标准溶液、OFL标准溶液、空白鸡肉提取液和含SM 2和OFL的鸡肉提取液的三维同步荧光光谱，确定Δλ/激发波长为150/292.5 nm（SM 2）和210/295 nm（OFL）。其次，采用单因素实验研究了β-巯基乙醇加入量、邻苯二甲醛加入量和时间对荧光强度的影响，得到了最佳检测条件：β-巯基乙醇加入量为300μL、邻苯二甲醛加入量为25μL和时间为44 min。最后，比较了基于峰高法和峰面积法的预测模型性能，选择了基于峰高法的预测模型作为分析模型。基于峰高法的SM 2残留预测模型的真实值与预测值之间的RMSEP为6.0605 mg/kg，回 收 率 为76.1%～115.2%，RSD为2.7%～7.0%。基于峰高法的OFL残留预测模型的真实值与预测值之间的RMSEP为0.5392 mg/kg，回 收 率 为96.7%～110.1%，RSD为2.8%～10.0%。由此表明，该方法可以满足快速检测鸡肉中SM 2和OFL残留的需求。