不同生长时间对美国皂荚壳皂苷的影响比较研究

徐 伟， 肖志强， 李纯懿， 蒋建新， 朱莉伟

(北京林业大学 材料科学与技术学院，国家林业和草原局木本香料(华东)工程研究中心，北京100083)

美国皂荚是一种雌雄异株的木本植物，属于豆科皂荚属，通常在五月底或六月初开花，并于冬季成熟[1],荚果呈月牙形，长度大约为15～20 cm。皂荚果壳中富含皂苷，美国皂荚壳皂苷由疏水性的皂苷元和亲水性的糖链组成，其中糖链主要由4种单糖组成，分别是葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖[2],皂苷的两亲性结构决定了皂苷具有较强的表面活性[3]。目前美国皂荚壳皂苷没有得到充分的开发与利用，虽然国内对美国皂荚壳皂苷的提取工艺研究报道较多[4-7]，但鲜见关于不同生长时间美国皂荚壳皂苷上糖基及表面活性的比较研究。因此本研究以不同采摘时间的美国皂荚果壳为原料，对其进行组分分析，对抽提得到的美国皂荚壳皂苷进行皂苷糖基测定，并对皂苷的表面活性进行评价和分析，旨在为美国皂荚壳皂苷资源的开发和综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料、试剂和仪器

美国皂荚(GleditsiatriacanthosL.)采摘于北京市海淀区北京林业大学(2019年)，采摘时间为其开花后的第15、 17、 19、 21、 23和25周。样品经过手工剥离得到皂荚壳，将皂荚壳置于50 ℃烘箱，烘干至恒定质量，然后经粉碎和过筛，选取粒径≤0.250 mm的部分，存于干燥器内备用。石油醚、丙酮、无水乙醇、浓硫酸、香草醛均为分析纯，北京化工试剂厂；L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖均为标准品，美国Sigma公司；AB-8型大孔吸附树脂，天津光复精细化工研究所。

Waters e2695型高效液相色谱仪，配备A minex HPX-87H柱和示差折光检测器，美国Waters公司；UV- 6100A紫外可见分光光度计，上海比朗仪器有限公司；FW100高速万能粉碎机、SX型箱式电阻炉控制箱，天津泰斯特仪器有限公司；R203型旋转蒸发仪；BSA2245-CW型电子分析天平；BZY-101型自动表面张力仪，上海方瑞有限公司；YSQ-LS型全自动灭菌锅，湖南恒诺仪器设备有限公司。

1.2 美国皂荚壳组分分析

1.2.1皂荚壳脂肪含量测定 称取不同生长时间的皂荚壳粉末30.0 g(绝干质量)并按照料液比1 ∶10(g ∶mL)加入石油醚(沸程60～90 ℃)，索式抽提8 h，将抽提液旋蒸浓缩并置于105 ℃烘箱，烘干至恒定质量，即为脂肪的质量。皂荚壳中脂肪的质量分数(y,%)根据下式进行计算：

y=m1/m×100%

(1)

式中:m1—脂肪的质量，g；m—原料的绝干质量，g。

1.2.2美国皂荚壳化学组成分析 根据美国再生能源实验室(NREL/TP-510- 42618)测定脱脂和脱皂苷后美国皂荚壳中灰分和三大素(纤维素、半纤维素和木质素)的组成[8]。

1.3 美国皂荚壳皂苷提取、单糖组成分析及含量测定

1.3.1美国皂荚壳皂苷的提取及纯化 按照料液比1 ∶10(g ∶mL)向经1.2.1节脱脂后的美国皂荚壳粉末中加入无水乙醇，索式抽提8 h后，将抽提液浓缩，真空干燥并研磨成粉末，得到美国皂荚壳粗皂苷。将各组美国粗皂苷溶于5倍体积的乙醇中，然后加入2倍体积的丙酮进行沉淀，重复以上操作2次。将沉淀后的皂苷配置成30 g/L的粗皂苷水溶液并上样至大孔吸附树脂柱(AB-8大孔吸附树脂)上，流速为1 mL/min[9]。吸附完成后，先用去离子水洗涤至无游离糖的存在，再分别用30%、 60%和90%的乙醇进行洗脱(30%和60%乙醇洗脱液中未检测到皂苷)，得到90%乙醇洗脱的皂苷样品，对洗脱液进行浓缩干燥，得到纯化的美国皂荚壳皂苷样品。

1.3.2美国皂荚壳皂苷单糖组成分析 每组称取适量不同生长时间的粗皂苷置于具塞耐压瓶中，加入2.5 mL的1 mol/L盐酸，于100 ℃水解1 h，反应结束后冷却至室温，离心取上清液，进行高效液相色谱检测，测定皂苷糖链上的单糖组成[5]。对脱皂苷后剩余固体残渣进行干燥。向干燥后的固体残渣中加入适量质量分数为72%的硫酸，并在30 ℃水浴摇床中水解1 h，然后加入适量的去离子水，121 ℃继续水解1 h[8]。将水解液用0.22 μm滤膜过滤，用高效液相色谱仪进行单糖组成分析。高效液相色谱检测条件为：流动相为5 mmol/L H2SO4，流速0.5 mL/min。使用L-鼠李糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖的单糖标准品进行校准。

1.3.3皂苷的最大吸收波长确定 称取一定质量的纯化皂苷样品，配置成1 g/L的皂苷标准液。吸取0.5 mL的皂苷标准液，依次加入0.5 mL 8%的香草醛溶液和4 mL 77%硫酸溶液，振荡摇匀，在60 ℃水浴中加热15 min，然后置于冰水浴中冷却10 min，在紫外分光光度计下进行200～800 nm的全波长扫描。由扫描结果可知，在545 nm处出现单峰且吸光度较高，因此选择545 nm作为美国皂荚壳皂苷的最大吸收波长。

1.3.4皂苷含量的测定 分别取0.1、 0.2、 0.3、 0.4和0.5 mL皂苷标准液，置于10 mL的具塞试管并加入0.5 mL体积分数为50%的乙醇，按照1.3.3节中方法加入香草醛-浓硫酸显色剂，在最大吸收波长545 nm下测定吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，纯化皂苷质量浓度(X)为横坐标制作标准曲线。得到线性回归方程：Y=2.192 4X+0.040 4，相关系数R2=0.999，在0.1～0.5 g/L的范围内，纯化的皂苷样品质量浓度与吸光度具有良好的线性关系，因此可以为不同生长时间的美国皂荚壳皂苷的定量测定提供依据。

取1.3.1节中6个采摘时间的美国皂荚壳粗皂苷，按1.3.4节方法测定其在545 nm下吸光度，并根据标准曲线计算皂苷的质量浓度。根据下式计算皂苷质量分数(y,%):

y=cV/m×100%

(2)

式中:c—粗皂苷水溶液中皂苷的质量浓度，g/L；V—粗皂苷水溶液的体积，L；m—原料的绝干质量，g。

1.4 皂苷表征

1.4.1红外光谱分析 采用Bruker-ALPHA 傅里叶变换红外光谱仪，将开花后21周的美国皂荚壳皂苷和90%乙醇纯化的美国皂荚壳2种样品在105 ℃烘干后，与 KBr 按照质量比1 ∶100进行压片，在波数为 400～4000 cm-1范围内进行扫描。

1.4.2表面张力测定 为了测定不同生长时间美国皂荚壳皂苷的表面活性，对6个组的美国皂荚壳皂苷进行表面张力测定，来确定其临界胶束浓度(CMC)。一般来说皂苷的CMC越低，则表面活性越好，更适合应用于制作表面活性剂。从6个组中分别取适量的粗皂苷，配置成一系列质量浓度梯度的粗皂苷水溶液(0.009～1.0 g/L)，在30 ℃下采用吊片法和自动表面张力仪测定各质量浓度样品的表面张力[10]。随后以溶液质量浓度对数为横坐标，表面张力为纵坐标绘制曲线，从曲线中判断表面张力不再有明显下降时所对应的最低浓度为CMC值。

2 结果与讨论

2.1 美国皂荚壳的组分分析

通过对美国皂荚壳的组分进行分析,发现纤维素、半纤维素、皂苷和木质素各组分含量变化，结果见表1。

表1 美国皂荚壳的组分分析

其中含量最多的是纤维素，其次是皂苷和木质素。李莹桥[11]也发现皂荚壳中含量最多的是纤维素，其次为皂苷。随着美国皂荚的不断生长和成熟，荚果壳的颜色逐渐加深，皂苷质量分数从11.17%(15周)逐渐增加到14.21%(25周)，说明皂苷的形成是逐渐合成和积累的过程[12]。不同生长时间的美国皂荚壳中脂肪质量分数均大于1%，其中开花后19周皂苷的脂肪质量分数最高，为1.39%。李莹桥[11]对山皂荚(GleditsiajaponicaMiq.)果壳的化学组成进行了研究，发现山皂荚壳中脂肪质量分数为2.30%，高于美国皂荚壳的脂肪质量分数。不同生长时间皂荚的灰分质量分数约为2.90%～3.83%，与文献报道的基本一致[13]。综纤维素质量分数变化随着生长时间不是很明显，最大值出现在19周为36.75%。

2.2 不同采摘时间皂苷上的单糖含量变化

皂苷主要是糖的半缩醛羟基与皂苷元结合的化合物[14-15]。皂苷经过酸水解生成皂苷元和各种单糖，皂苷元以不溶于水的沉淀的形式存在，而各种单糖主要存在于水解液中。从图1美国皂荚壳皂苷上单糖的高效液相色谱图中可以看出，保留时间11.42、 12.32、 12.89和13.33 min对应的色谱峰分别是葡萄糖、木糖、鼠李糖和阿拉伯糖。美国皂荚壳皂苷上糖链经过盐酸水解后，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖各峰分离效果良好，可以达到基线分离。图2为皂苷中各单糖及总糖的含量分析，由图可知木糖、葡萄糖和阿拉伯糖是皂苷糖链上主要的单糖，而鼠李糖的含量相对较少。

图2 不同生长时间美国皂荚壳皂苷上单糖及总糖含量变化

Yu等[16]也发现皂荚皂苷糖链上单糖主要有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖。随着美国皂荚的生长和成熟，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖得率都先降低后增加，在开花后的21周达到最小值，总糖得率的趋势与单糖得率的趋势一致。葡萄糖、阿拉伯糖和鼠李糖得率波动趋势不大，而木糖得率波动最大，由15周时的 9.97%降至21周的1.43%。皂苷上糖含量的变化可能是与皂荚内养分和能量的分配方式有关，因此测定了15周至25周皂荚胚乳中半乳甘露聚糖含量的变化，结果如表2所示。从15周到21周皂荚胚乳内甘露聚糖和半乳甘露聚糖含量逐渐增加，这可能是由于在皂荚生长过程中，皂荚内养分和能量主要用于甘露糖基转移酶合成甘露聚糖，增加了甘露聚糖含量[17-18]，使得供给美国皂荚皮皂苷上糖基合成的能量和养分有所降低，因此，在此期间美国皂荚壳皂苷上单糖含量逐渐降低。在21周以后胚乳内半乳甘露聚糖合成结束，含量不再增加，此时荚果中的养分和能量主要用于美国皂荚壳皂苷上糖基的合成，从而使21周后皂苷上单糖含量不断增加。

表2 不同生长时间美国皂荚胚乳中半乳甘露聚糖含量的变化

2.3 皂苷表征

图3 美国皂荚壳皂苷的红外光谱图(开花后21周)

2.3.2不同成熟期美国皂荚壳皂苷表面活性的测定 30 ℃下不同采摘时间的美国皂荚壳皂苷表面张力随浓度的变化规律如图4所示。

随着美国皂荚壳皂苷质量浓度逐渐增加，皂苷的表面张力逐渐降低，21周皂荚壳皂苷溶液质量浓度从0.009 g/L升高至1 g/L,表面张力从57.60 mN/m降低至44.57 mN/m，达到最低值。进一步增加皂苷质量浓度，美国皂荚壳皂苷在溶液表面已经达到饱和状态，表面张力不再降低，此时的浓度称为临界胶束浓度(CMC)。CMC值愈小，皂苷在溶液中形成胶束所需的浓度愈低，使溶液表面张力降低到最低值所需的浓度愈低，即表面活性愈高[19]。此外，表面活性的高低也与皂苷两亲性结构密切相关。15～21周采摘的美国皂荚荚果内养分和能量可能主要用于合成胚乳内半乳甘露聚糖使得合成美国皂荚壳皂苷上单糖的养分和能量减少，从而使皂苷的亲水性糖基含量降低，进而会使皂苷的疏水性增加，CMC降低，皂苷的表面活性增加[20]。表3总结了不同生长时间皂苷的最低表面张力和临界胶束浓度值，从表中可以看出，15到21周采摘的皂荚中皂苷的临界胶束浓度值逐渐降低，在21周达到最低值(临界胶束浓度为0.07 g/L)，说明在此期间皂苷的表面活性随着生长时间的增加而逐渐增大。这可能是由于从15周到21周皂苷上亲水性单糖含量(葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖)逐渐降低，皂苷分子容易克服水分子的吸引力，疏水作用增强，表面活性增加，因此21周采摘的美国皂荚壳皂苷的表面活性最佳(临界胶束浓度为0.07 g/L)。而23～25周采摘的美国皂荚皂苷的临界胶束浓度值逐渐增加，可能是由于皂苷上亲水的单糖含量逐渐增加，使皂苷的亲水性增加，皂苷分子不容易克服水分子的吸引力，从而使表面活性降低。与商业上茶皂苷的临界胶束浓度(1.5 g/L)相比，美国皂荚壳皂苷的临界胶束浓度(0.07～0.50 g/L)更低，说明美国皂荚壳皂苷具有更加良好的表面活性，能有效降低水的表面张力。研究发现，高表面活性的皂荚皂苷能够增强酶水解效率，有利于糠醛和乙酸的转化，有利于木质纤维原料的高值化利用[21-22]。

表3 美国皂荚壳皂苷不同采摘时间下CMC 和γCMC

3 结 论

3.1对不同采摘时间下得到的美国皂荚壳进行提取得到粗皂苷样品，然后经90%乙醇洗脱得到纯化皂苷样品。对皂荚壳的组分分析发现美国皂荚壳皂苷的含量随生长时间的增加而逐渐增加，说明在皂荚壳中，皂苷的形成是逐渐合成和积累的过程。

3.2对不同生长时间皂苷上的糖基进行酸水解和高效液相色谱分析，结果表明：美国皂荚壳皂苷上糖基主要由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和鼠李糖组成，其中木糖、葡萄糖和阿拉伯糖含量较高，而鼠李糖的含量相对较少。总糖和单糖含量随生长时间的延长呈先降低后升高趋势，在开花后第21周糖含量到达最低值。

3.3红外光谱结果证实了粗皂苷样品和纯化后的皂苷样品均具有皂苷的基本红外特征峰。不同生长时间的美国皂荚壳皂苷的表面活性评价表明，随着生长时间的增加临界胶束浓度逐渐降低，在开花第21周达到最低值(0.07 g/L)，此时最低表面张力为44.57 mN/m。在美国皂荚的生长和成熟过程中，随着皂苷上糖基含量降低，疏水性增强，临界胶束浓度降低，21周采摘的皂荚壳皂苷的单糖含量最低，且表现出最佳的表面活性。