增氧剂和消毒剂对渔业水体中磺胺甲噁唑消解动态规律的影响研究

方龙香，黄铢玉，宋超, *，单祥保，胡庚东, ，裘丽萍, ，陈家长, *

(1. 农业农村部水产品质量安全环境因子风险评估实验室， 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心， 江苏 无锡 214081；2. 农业农村部水产品质量安全控制重点实验室， 北京 100141； 3. 南京农业大学无锡渔业学院， 江苏 无锡 214081)

水产养殖业是世界上蓬勃发展的产业之一[1-2]，水产品具备高蛋白和高营养的特点，深受消费者青睐。联合国粮食及农业组织报告显示，2014年中国是世界上最大的水产品生产国和出口国[3]。随着中国规模化、集约化养殖模式的发展，为预防和治疗水产养殖过程中发生的疾病，养殖生产中不可避免大量使用抗生素[2, 4]。磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole, SMZ)是一种中效磺胺类药物，属广谱型抗菌药，具有抗菌谱广、疗效强以及方便安全等特点，在淡水和海水养殖中都有使用，主要用于疾病的预防和治疗，或者作为饲料添加剂以促进水产品的生长[5]。抗生素在养殖业中的广泛使用，尤其是不规范使用，导致动物性食品中药物残留现象时有发生，人类长期摄入含有SMZ残留的食品，因蓄积而产生的毒性作用将造成肾脏等器官损伤[6-7]。因此，养殖环境中SMZ的残留问题需要得到重视。现阶段关于SMZ的研究主要集中于SMZ在水产品中的药物代谢动力学研究及动物源性食品中的残留检测等[8-9]，而对于水环境中SMZ消除方法的研究较少。

在水产养殖的日常管理中，养殖环境的改善极为重要，除了养殖池塘中开增氧设备，养殖结束后清塘、晒塘等，养殖户也会使用增氧剂和消毒剂等化学药品，如过氧乙酸和二氧化氯消毒片等[10]调节池塘环境。研究发现，增氧剂和消毒剂在一定程度上可以影响水体中药物的降解，但关于投入品对SMZ消除规律影响的研究甚少。因此，探究增氧剂和消毒剂对SMZ消除规律的影响具有重要意义，可为降低渔业养殖水体中SMZ残留提供新方案。

过碳酸钠和次氯酸钠是养殖户常用的增氧剂和消毒剂，价格低廉，效果明显[11-12]。本试验选定过碳酸钠和次氯酸钠为实验材料，根据实际养殖活动中的添加剂量设置不同水平，并用液相色谱-质谱/质谱测定试验周期内SMZ的浓度变化。探究不同浓度的过碳酸钠和次氯酸钠对SMZ消除的影响，为养殖池塘的SMZ残留消除提供理论基础和技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

仪器：超高效液相色谱-质谱/质谱仪(美国Waters公司)；便携式水质多参数检测仪(哈希水质分析仪器有限公司)；固相萃取装置(SPE)(上海安谱实验科技股份有限公司)。

试剂： SMZ(纯度大于>99%)购于Dr.Ehrenstorfer公司。甲醇和甲酸为色谱纯，分别购于德国默克试剂公司和上海安谱实验科技股份有限公司。所有标准品均用甲醇溶解，保存于-20 ℃条件下备用。过碳酸钠和次氯酸钠试剂均为分析纯，均购于国药集团。试验前处理过程中所用水均为超纯水。

材料：试验所用固相萃取柱为HLB小柱(安谱，Poly-Sery HLB SPE Cartridge 500 mg，6 mL)。

1.2 试验设计

试验环境条件保持温度为(25±2)℃，光周期为12 L∶12 D。试验期间通过空调调节室温来维持试验水体温度的稳定，对试验缸(55 cm×30 cm×20 cm)内水体温度进行实时监测，并增设照明装置(30 W日光灯)模拟光照，光照强度为2 500 Lux左右，光照时长由便携式插座定时转换器控制。根据相关地区池塘养殖水体中的SMZ检出结果，每个实验缸中SMZ的添加浓度为50 μg/L。

根据实际池塘养殖管理过程中过碳酸钠和次氯酸钠的使用量，选定试验设计药品添加浓度，如表1所示。设置1个对照组和6个不同浓度药物添加组，每组分别设置3个平行试验。试验周期为10 d，分别对缸内水样进行8次取样(0.5、1、2、3、4、7和10 d)，以确定水中SMZ浓度的变化情况，同时利用哈希溶氧仪分别对试验组的pH和溶氧变化进行监测，并用余氯试纸(0～25 mg/L指示范围)测定试验周期内不同次氯酸钠添加试验水体中余氯值的差异。

表1 试验方案设计Tab.1 Experiment scheme

1.3 样品分析

1.3.1 样品前处理方法[13]

每次取样前，将水体搅拌均匀，取50 mL水样于50 mL离心管中，用固相萃取方式对目标药物进行萃取浓缩。选用HLB萃取小柱，先用5 mL甲醇和 5 mL 水活化柱子，接着上水样，再加2 mL纯水淋洗，水样抽干后再用5 mL甲醇分2次洗脱，用离心管收集洗脱液，定容至5 mL。洗脱液摇匀后取适量用甲醇稀释至标准曲线范围内，样品过0.22 μm的有机相滤膜后转移至1.5 mL进样小瓶待测。

1.3.2 样品检测方法

液相色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18column，2.1×100.0 mm，直径i.d.=1.7 μm；柱温30 ℃；流速0.3 mL/min；进样量5 μL。流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸甲醇溶液，流动相梯度洗脱程序见表2。

质谱条件：离子源为电喷雾离子源ESI+；采集方式为多反应监测模式MRM；毛细管电压3.5 kV；锥孔电压30 V；离子源温度450 ℃；脱溶剂气温度450 ℃；脱溶剂气流速800 L/Hr；锥孔气体流速设为50 L/Hr。其他参数条件如表3所示，其磺胺甲噁唑标准品的总离子图和定量离子图见图1。

表3 仪器参数Tab.3 Instrument parameters

图1 浓度为50 μg/L的磺胺甲噁唑标准品的总离子图和定性定量离子色谱图Fig.1 TIC as well as the qualitative and quantitative ion chromatogram of SMZ standard at the concentration of 50 μg/L

1.3.3 样品定量方法

考虑实验过程中水体SMZ浓度随着试验的消解情况，在1～50 μg/L范围内配制梯度标准溶液。实验前对空白水样进行SMZ加标处理，并以响应最高的子离子92.084对应的响应峰面积进行定量，利用外标法对样品中SMZ进行定量计算，在养殖水样本中5～15 μg/L添加浓度水平上的回收率为88.20%～95.31%，本方法的相对标准偏差≤15%。以样品上机3倍和10倍信噪比计算出方法的检出限和定量限，其检出限为0.01 μg/L，定量限为0.03 μg/L。

1.4 统计分析

根据液相色谱-质谱/质谱定量检测得出水中各个时间段药物浓度，再通过一级反应动力学方程对试验处理组的浓度变化进行拟合，方程如下:

Ct=C0e-kt

式(1)

其中Ct表示药物在时间t的浓度，μg/L；C0为药物初始浓度，μg/L;t为持续时间，d;k为消除速率常数，并通过以下方程计算半衰期：

T1/2=(ln2)/k

式(2)

通过药物初始浓度C0，与药物在时间t的浓度Ct计算各阶段药物的消除率：

式(3)

最后对结果做进一步的方差分析，检验各因素对SMZ降解影响的显著性。

本试验所有数据主要运用SPSS 19.0软件进行分析处理，并在95%置信水平下(α=0.05)，进行方差分析和相关性分析，并用Origin 9.1软件绘制数据图。

2 结果

2.1 磺胺甲噁唑消除半衰期

试验各组的半衰期值各不相同，磺胺甲噁唑半衰期范围为4.66～12.80 d(图2)。在过碳酸钠添加组中，仅T3组SMZ的半衰期与对照组差异显著(P<0.05)，且显著低于其他各处理组。其余各浓度组的半衰期与对照组无显著差异(P>0.05)。在次氯酸钠添加组中，各浓度水平组的半衰期与对照组差异均不显著。结果表明最高浓度处理组的过碳酸钠对SMZ的降解效果显著，且过碳酸钠组处理效果优于次氯酸钠处理组。

图2 各试验组磺胺甲噁唑的半衰期值不同字母表示各组间半衰期存在显著性差异(P<0.05)。Fig.2 Half-life value of SMZ in each test groupDifferent letters indicate significant differences between groups(P<0.05).

2.2 磺胺甲噁唑消除率

在观察各试验组消除差异的同时，通过消除速率的计算方程可以得出SMZ在试验期间消除速率的变化规律(图3)。在过碳酸钠添加组中，相对于对照组，3个处理组消除速率均在药物添加1 d之内有较高水平的增长，T3组消除速率逐渐降低，其余2组消除速率在2 d后趋于平缓(图3A)，7 d内T3组消除速率始终高于其他组。在次氯酸钠添加组中，同样在1 d之内各组的消除速率达到最高水平，但各试验组与对照组之间的消除速率差异不显著。消除速率的组间变化与半衰期变化相似，T3组对消除效果有较为明显的影响，且过碳酸钠处理组的效果优于次氯酸钠处理组。

图3 过碳酸钠(A)、次氯酸钠(B)处理组与对照组间的消除速率变化Fig.3 The change of elimination rates of sodium percarbonate (A) and the sodium hypochlorite (B) in treatment and control groups

2.3 试验检测指标的分布水平及相关性分析

图4为试验期间过碳酸钠处理组和次氯酸钠处理组的相应指标在各组间的均值分布水平，即表示不同药物浓度添加之间相应指标的均值差异。在过碳酸钠处理组中，溶解氧在组间的波动水平为6.32～7.44 mg/L, 3组的溶解氧含量与对照组均有显著差异(P<0.05)，表明添加过碳酸钠浓度较低时，水体溶解氧的含量会产生较大差异；pH的波动范围为7.93～8.51，T2组pH显著低于对照组，T3组pH显著高于对照组；组间半衰期数值变化趋势与pH相近，T3组变化最为显著。在次氯酸钠处理组中，余氯的波动范围为0.36～0.52 mg/L，3个处理组余氯含量与对照组均不显著；pH的波动范围为8.05～8.10，T4组pH显著高于对照组，其余各组与对照组间差异不显著，可能由于试验组次氯酸钠的添加浓度过低，导致试验组均无明显差异；半衰期数值变化趋势与pH及余氯的变化较为相似。

图4 过碳酸钠(A)、次氯酸钠(B)处理组与对照组间各检测指标的水平分布*表示各处理组件差异显著。Fig.4 Distribution of various indicators of the sodium percarbonate (A) and sodium hypochlorite (B) in treatment group and the control group* indicated a significant difference between treatment groups.

对试验期间各指标进行Spearman相关性分析，试验结果如表4所示。溶解氧与消除率之间的相关性系数为0.509(r>0.5)，即两者存在显著性的正相关关系。余氯与消除率之间的相关性系数为0.385，表明两者存在低度正相关关系(0.30.5),即两者存在显著的正相关关系。

表4 各因素组合之间的相关性分析Tab. 4 Correlation analysis between various factor combinations

3 讨论

3.1 过碳酸钠的消除效果探讨

过碳酸钠遇水释放活性氧，被养殖户用来增加养殖水体溶氧量[14-15]，还常被用来消毒和吸附或降解水体中的有机污染物。本试验中，过碳酸钠添加浓度为40 mg/L时，可有效促进水体中SMZ的消除。通过室内模拟试验，发现化学氧化剂对SMZ的降解作用主要发生在与水体接触后12 h之内，SMZ的消除速率达到最高。季丽等[16]研究发现过碳酸钠的浓度为0.15 mg/L时可在5 h之内有效降解44.13%的氟乐灵，本研究的消除效果也较为缓慢，表明过碳酸钠在进入水体的短时间内对不同药物的作用效果有差别。

过碳酸钠作为氧化剂，考察其氧化能力主要看其进入水体后的作用产物，过碳酸钠加入水体后形成过氧化氢和碳酸钠，以过氧化氢来体现其氧化性[17-18]。钱卉[19]研究发现过碳酸钠在水体中能有效降解水中的拟除虫菊酯，但其试验使用的过碳酸钠浓度高达250 mg/L。因此，本研究中水体SMZ未能快速降解，可能与水体中过氧化氢没能达到相应水平有关。

过碳酸钠溶于水可分解出活性氧，具有很强的氧化能力，其用途十分广泛，可用作果蔬保鲜、消毒和吸附或降解水体中的有机物等[15, 20-21]。过碳酸钠具有与过氧化氢的相同性质，其水溶液呈碱性，含3%的过碳酸钠水溶液pH值可达到10～11，本研究中过碳酸钠添加浓度为40 mg/L时，水体pH已经达到9左右，此时的pH条件足以对SMZ的降解产生显著作用。所以说过碳酸钠的消除效果主要源于其对水体中pH的改变。相关性分析也表明，水体pH值与SMZ的消除率变化呈显著正相关关系。在过碳酸钠添加初期，3个不同添加水平组的消除速率均较对照组有明显的升高，但是仅最高添加水平组的水体pH值明显高于对照组。从消除速率变化和相应的pH值水平来看，过碳酸钠处理组中SMZ的消除除了受水体pH值水平影响，还与过碳酸钠的浓度水平相关。这一结果与钱卉[19]的研究结果相吻合，其发现过碳酸钠除在中性条件下消除效果较差外，在酸性和碱性条件均可以有效降解水中的SMZ。总体来说，过碳酸钠可以通过直接和间接的方式消除水中的SMZ残留。

3.2 次氯酸钠的消除效果探讨

次氯酸钠常被用作水体消毒剂[22]，也是水产养殖的常用药[23-24]。此次研究发现添加的次氯酸钠浓度均对水中SMZ的消除影响不显著。次氯酸钠溶于水后会形成有效氯，其有效成分为HClO和ClO-[12]。相关研究发现，有效氯中发挥氧化作用的主要是HClO，但只有在pH<7.5时，有效氯的主要成分才为HClO，有较强的氧化作用[25]。养殖环境水体pH普遍大于7.5，次氯酸钠溶液主要以ClO-形式为主，所以次氯酸钠很难直接对SMZ产生氧化作用[26]。但其机理与过碳酸钠相似，次氯酸钠加入水体后会使得水体pH值升高[27]。本研究的试验水体pH>8，故而次氯酸钠对水体SMZ的消除作用主要表现在水体pH升高后的水解作用。

次氯酸钠也常被用作水产品加工厂中生产人员的手、工具的消毒，郝志明等[28]研究发现含有效氯300 mg/L次氯酸钠溶液作用30 min可将枯草黑色变种芽孢杆菌(Bacillussubtilis)完全杀菌，含有效氯50 mg/L的次氯酸钠溶液对生产人员双手的大肠杆菌(Escherichiacoli)作用1 min能达到完全的杀菌效果。

通过方差分析，可以看到次氯酸钠试验组的半衰期之间差异不显著，并且显著低于T3组。表明本试验条件下次氯酸钠对SMZ的消除效果弱于过碳酸钠。此外，在实际的养殖管理活动中，过碳酸钠对水体无副作用，因而在施用浓度上没有过多限制[29-30]，而次氯酸钠在施用过程中在水体中产生的有效氯会造成一定的负面影响[31-32]。研究表明次氯酸钠对刺参(Stichopusjaponicus)幼体安全浓度为0.46 mg/L，对罗氏沼虾仔虾(Macrobrachiumrosenbergii)和幼虾安全浓度分别为40.74 mg/L和18.77 mg/L[33]。所以，若利用次氯酸钠消除水体中的SMZ时，不仅要考虑次氯酸钠对水体pH值的影响，还要考虑其本身对养殖生物的直接影响[31]。因此，在消除养殖水体中的SMZ时，过碳酸钠的使用有较高的优势[12]。

4 结论

本研究结果表明高浓度过碳酸钠的施用对渔业水体中SMZ的消除有显著作用，说明常规养殖管理活动中添加增氧剂在一定条件下会对养殖水体中SMZ的消除产生积极作用。在实际养殖管理过程中，可以借助提高水体pH的方式或添加高浓度的过碳酸钠来降低水体中SMZ的残留，但是需要根据养殖品种以及池塘水体环境条件确定合适的添加水平。