不同水解工艺对鱼溶浆蛋白水解效果的影响

孟莹，江晓，孙建安*，毛相朝

(1. 中国海洋大学食品科学与工程学院， 山东 青岛 266003；2. 青岛滨海学院医学院， 山东 青岛 266555)

鱼溶浆以鱼粉加工过程中得到的压榨液为原料，经脱脂、浓缩或水解后再浓缩获得，是水分含量不高于50%的膏状产品，主要被作为饲料原料[1]；其价格低廉，各种营养成分保存比较完整，在饲料上的利用效果也优于同类原料制成的鱼粉，是水产品加工业的重要组成部分[2]。Ahmad等[3]研究了鱼溶浆对大豆浓缩蛋白的增塑和结合作用，证实了其在鱼饲料挤出过程中用作增塑剂和粘合剂的潜力。Espe等[4]发现向大西洋鲑(Salmosalar)基于植物蛋白的日粮中添加鱼溶浆，并不会影响其自愿采食量和改善其生长。Newport等[5]的研究表明在幼猪的日粮中添加鱼溶浆会使小肠中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的量减少。鱼溶浆的主要营养成分是蛋白质，利用蛋白水解技术以鱼溶浆为原料制备高游离氨基酸蛋白水解物，可以提高其营养特性。吴代武[6]发现在高植物蛋白饲料中使用酶解鱼溶浆可有效提高饲料原料的利用效率，促进黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)生长。因此，如何提高鱼溶浆的水解度，获得富含游离氨基酸的高水解度鱼溶浆溶液，对进一步改善鱼溶浆品质、提高其附加值、促进其在饲料行业中的应用具有重要意义。

蛋白水解方法主要有化学法和生物法，其中化学法主要是酸法和碱法，生物法则主要采用酶对蛋白质进行水解[7]。酸法处理过程简单、水解度高，但水解过程往往较剧烈，易对蛋白造成破坏；碱法可能引起蛋白质消旋，产生各种不良的二级化合物如D-氨基酸等，难以去除[8]；酶法由于作用条件温和、过程易于控制已被广泛应用于水解蛋白的制备。李琳等[9]以低值鱼为原料，采用深度酶解技术(碱性蛋白酶和风味蛋白酶两步酶解)制备出卫生、安全且氨基氮含量高的酶解液并以此为基料开发风味适宜的天然复合调味料。刘伟峰[10]以蓝圆鲹(Decapterusmaruadsi)为原料，采用碱性蛋白酶和风味蛋白酶对分离蛋白进行酶解改性，研究了限制性酶解对分离蛋白溶解性、乳化性及持油性等功能特性的影响机制。陈彦等[11]探讨了以低值鱼蛋白为原料，通过酸法、酶法制备高值鱼蛋白相关产品的水解工艺。此外，酶解避免了对高水分、高油脂的鱼溶浆原料进行高温高压的烘干处理，使之直接进入饲料配合和生产流程，更好地保全了原料的有效性及热敏物质的生理活性，提升了饲料产品的功能性[12]。杨城[13]从鱼粉水解液中筛选出一株产酸性蛋白酶菌株，并利用发酵粗酶解液酶解鱼溶浆蛋白，所得的氨基酸原液在提高作物抗逆性方面具有良好的应用效果。林晓华等[1]利用来自猪胰脏的胰酶酶解鱼溶浆，发现当料液比1∶ 2.8、加酶量14.6%、酶解温度45.1 ℃、酶解时间4.3 h时鱼溶浆酶解液中酸溶蛋白含量可达38.0%。Ikasari等[14]利用酸法和碱法以线鳢(Channastriata)副产品为原料制备鱼溶浆，发现虽然采用这两种方法生产的鱼溶浆在得率、蛋白和脂肪含量上没有显着差异，但酸法得到的产品具有更高的营养价值。酸法可以得到较高水解度的产品，但往往产品品质遭到不同程度的破坏；酶法条件温和、产品品质好，但往往水解度不高。将两种水解方法耦合使用，可能会得到兼具较高水解度和较好品质的产物。目前为止，尚未见不同酸解、酶解及复合水解法对鱼溶浆水解效果的比较研究。

本研究以鱼溶浆为原料，探讨了不同条件下的单酶水解、复合酶水解、酸水解和酸酶耦合水解法对鱼溶浆的水解效果，在此基础上建立了酸酶耦合水解工艺，为游离氨基酸含量高的鱼溶浆水解液制备提供理论依据和技术支持，从而推动鱼溶浆的高值化加工与应用[13]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 鱼溶浆(浓度：35%，粗蛋白≥35%，水分含量≤40%，灰分≤10%，pH 5～7)，购自温州守诚化工科技有限公司。

1.1.2 蛋白酶：木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、复合风味蛋白酶、碱性蛋白酶，购自山东西唐生物科技有限公司。

表1 各蛋白酶酶活及最适酶解条件Table 1 Optimal enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes

1.1.3 氢氧化钠、中性甲醛、柠檬酸、盐酸、硼酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、碳酸钠、福林酚及酚酞,购自国药集团，均为分析纯。

1.1.4 仪器：PL202-S电子天平(Metteler Toledo公司)；凯氏定氮仪Kjeltec TM 8400(丹麦Foss公司)；THZ-82恒温水浴摇床(力辰科技有限公司)；FC酶标仪 (Thermo Fisher Scientific)；超高速小型离心机(德国sigma公司)；PHSJ-6L型pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；GI80TW高压灭菌锅(厦门致微仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 鱼溶浆蛋白含量测定采用自动凯氏定氮仪法，按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》。

1.2.2 蛋白酶活力的测定采用福林法，按照行业标准SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》测定。

1.2.3 水解度测定

游离氨基态氮的测定采用甲醛滴定法[15]，总氮测定采用凯氏定氮法[16]。取2 mL样品，加入5 mL蒸馏水，滴加1% 酚酞溶液5滴，加入2 mL甲醛，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至粉色，滴定所消耗的标定碱的物质的量即为体系中游离氨基的物质的量，从而测定发酵液的水解度。水解度计算公式如下：

A2=(V-V0)×C×14.008/2

式(1)

DH=A2/A1×100%

式(2)

式中，V为样品组消耗的NaOH体积(mL)；V0为空白组消耗的NaOH体积(mL)；A1为酶解液中总的氨基态氮含量(mg/mL)；A2为不同水解时间酶解液中游离氨基态氮含量(mg/mL)；C表示NaOH摩尔浓度(mol/L)。

1.2.4 单酶水解

1.2.4.1 蛋白酶的筛选

鱼溶浆与水1∶10(w/v)配成底物液，分别加入3 000 U/g 的木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、菠萝蛋白酶和复合风味蛋白酶；50 ℃、180 r/min水浴振荡1 h，灭酶，8 000 r/min离心10 min，测定水解度。

1.2.4.2 加酶量优化

鱼溶浆与水1∶10(w/v)配成底物液，分别加入0、500、1 000、2 000、3 000和4 000 U/g中性蛋白酶，50 ℃、180 r/min水浴振荡，在酶解1 h时取样，灭酶，8 000 r/min离心10 min，测定水解度。

1.2.4.3 料液比优化

鱼溶浆与水配成1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶10(w/v)底物液，分别加入1 000 U/g中性蛋白酶，50 ℃、180 r/min水浴振荡，酶解1 h取样，灭酶，8 000 r/min离心10 min，测定水解度。

1.2.4.4 初始pH优化

鱼溶浆与水配成1∶10(w/v)底物液，分别调pH至5、6、7、8、9和10，加入1 000 U/g中性蛋白酶，50 ℃、180 r/min水浴振荡，在酶解1 h时取样，灭酶，8 000 r/min离心10 min，测定水解度。

1.2.4.5 温度优化

鱼溶浆与水配成1∶10(w/v)底物液，加入1 000 U/g中性蛋白酶，分别在45、50、55、60和65 ℃下，180 r/min水浴振荡反应，再酶解1 h取样，灭酶，8 000 r/min离心10 min，测定水解度。

1.2.4.6 正交试验

根据单因素实验结果，确定酶解温度(A)、初始pH(B)、加酶量(C)和固液比(D)4个因素的水平，设置4因素3水平正交实验，测定水解度，获得最佳酶解条件。实验因素及水平详见表2。

表2 正交实验设计因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment design

1.2.5 复合酶水解

1.2.5.1 复合酶同步酶解

选择木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶两两组合(1∶1)进行酶解，组合及分组如表3。

表3 复合酶水解设计表Table 3 Design of complex enzyme hydrolysis

1.2.5.2 复合酶两步法酶解

鱼溶浆与水配成1∶10(w/v)底物液，加入1 000 U/g中性蛋白酶， 50 ℃、180 r/min水浴振荡1 h，沸水灭酶15 min，冷却后，分别加入1 000 U/g木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶，再50 ℃、180 r/min水浴振荡反应1 h，取样、4 ℃离心(8 000 r/min，10 min)，测定水解度。

1.2.6 酸酶复合法水解

1.2.6.1 盐酸-酶复合水解

分别以5%、10%、15%和20%盐酸将鱼溶浆底物液及酶解液(料液比1∶15，加酶量2 000 U/g，50 ℃，1 h)在121 ℃下水解20 min，调pH至中性后测定水解度；待溶液冷却后加入2 000 U/g中性蛋白酶，50 ℃下反应1 h，测定水解度。

1.2.6.2 柠檬酸-酶复合水解

分别将5%、10%、15%和20%的柠檬酸(w/v)加入底物液、酶解液(料液比1∶15，加酶量2 000 U/g，50 ℃，1 h)中，121 ℃下反应20 min，调pH至中性后测定水解度；反应后的溶液冷却后加入2 000 U/g中性蛋白酶，50 ℃下反应1 h，测定水解度。

1.2.6.3 常压下的酸-酶复合水解

分别以5%、10%、15%、20%的盐酸和5%、10%、20%、30%、40%的柠檬酸处理鱼溶浆底物液及酶解液(料液比1∶15，加酶量2 000 U/g，50 ℃，1 h)，各处理组在100 ℃下反应1 h，测定其水解度。

1.2.7 数据分析

采用Excel 2018处理数据，采用Origin 2018作图。每组实验设置2个平行，采用 SPSS 18.0 软件进行单因素实验统计学显著性分析(ANOVA)，P<0.05表示有显著差异。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶的筛选

酶种类是酶解过程中最重要的影响因素之一[17]。由于酶的特异性，不同酶作用于同种底物会得到不同水解度(DH)的酶解液。DH影响肽的大小和氨基酸组成，从而调节其生物活性。用DH来测定蛋白质的水解，是测定蛋白质水解制剂的功能和生物性质的重要参数[18-19]。如图1所示，中性蛋白酶水解度最高，为(39.13±0.79)%，显著高于其他组(P>0.05)，故选择中性蛋白酶进行下一步酶解条件优化。

图1 不同蛋白酶对鱼溶浆蛋白的酶解效果不同小写字母表示组间差异显著(P<0.05)，下同。Fig.1 The hydrolysis effect of different proteases on condensed fish soluble proteinDifferent lowercase letters indicate significant differences between groups(P<0.05), the same below.

2.2 加酶量优化

一般情况下，水解度随加酶量的增加及酶解时间的延长而增加。蛋白酶将大分子肽段分解为分子量更小的肽段和游离氨基酸，使酶解液中游离氨基酸增加而大分子肽段减少。如图2，酶解前鱼溶浆水解度为(26.37±0.52)%，添加蛋白酶后鱼溶浆水解度(DH)在1h内迅速升高：加酶量3 000 U/g，酶解1 h水解度为(42.69±0.35)%，而加酶量1 000 U/g，酶解1 h水解度为(38.52±2.55)%，考虑成本及效率选择加酶量1 000 U/g。

图2 加酶量对水解度的影响Fig.2 Effects of enzyme dosage on degree of hydrolysis

2.3 料液比优化

如图3，1小时内，水解度随料液比的降低不断升高，料液比1∶5，酶解1 h水解度为(37.86±1.10)%，料液比1∶10，酶解1 h时水解度为(38.32±0.09)%，组间差异不显著(P>0.05)。

图3 料液比对水解度的影响Fig.3 Effects of material-to-liquid ratio on degree of hydrolysis

料液比降低使蛋白酶更加均匀地分散于反应体系，与底物接触并对其发生作用；料液比降低也使得酶解过程中产生的小分子物质在体系中迅速扩散，防止局部产物浓度过高而抑制酶解反应的进行；而当底物浓度降低到一定水平，水解度和多肽转化率增长速率减缓或停滞，这是由于一种酶对特定蛋白的水解能力是有限的，料液比降低使酶与底物浓度均有所降低，从而减缓反应速率[20]。料液比太低、溶液太粘稠，不利于水解操作，料液比太高，使水解液氨基酸浓度偏低，综合考虑选取料液比1∶10作为最优条件。

2.4 初始pH优化

酶促水解释放出可溶性小肽及新的羧基和氨基，增加暴露的亲水基团的数量，使得更多带电和极性基团暴露在周围的水中[21]，酶促水解使反应体系的pH发生变化。在恒定pH条件下进行蛋白质水解通常比不受控制的pH方法更快[22]，经测定，初始pH 5～8组酶解前后pH无明显变化，而初始pH 9、10组酶解后pH略有降低。如图4，随着初始pH的升高，水解度呈现先增长后降低的趋势，初始pH 6(自然pH)时水解度最高，为(38.01±0.18)%，显著高于其他组(P<0.05)，最有利于鱼溶浆的水解。

图4 初始pH对水解度的影响Fig.4 Effects of initial pH on degree of hydrolysis

2.5 酶解温度优化

蛋白酶的最适反应温度受水解底物蛋白性质的影响。温度对蛋白酶的作用具有两面性，升高温度能够提高水解速率，但同时也会加快蛋白酶热变性[20]。如图5，随着温度的升高，水解度先增高后降低，50 ℃下水解度最高，为(38.76±0.18)%，显著高于 60 ℃、65 ℃组(P<0.05)，而与45 ℃、55 ℃组无显著性差异(P>0.05)，然而45 ℃酶解1 h后酶解液不良气味更重，故选择50 ℃作为最优条件。

图5 温度对水解度的影响Fig.5 Effects of temperature on degree of hydrolysis

2.6 正交试验结果

鱼溶浆酶解正交优化试验结果如表4所示。从R值分析可得知，酶解温度(A)、pH(B)、加酶量(C)和固液比(D)对水解度的主次效应为：D>B>A>C，即固液比对水解度的影响最大，其次是初始pH，加酶量对水解度的影响最小。最终优化组合为A2B1C2D3，即当酶解温度为50 ℃，初始pH 5，加酶量2 000 U/g，固液比1∶15时，酶解效果最佳，此时水解度可达到40.37%。

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal experiments

3 复合酶水解工艺

3.1 复合酶同步水解

单酶水解法由于仅仅使用一种酶，其识别位点偏少，因此水解程度有限，即使进行了酶解条件的优化，水解度仍然偏低。若采用复合酶水解，增加酶的种类从而增加水解识别位点，则有可能提高水解度。王可琦等[23]以鲽鱼(Pleuronichthyscornutus)下脚料为原料，以中性蛋白酶和风味蛋白酶2∶1复合水解水解度比中性蛋白酶和风味蛋白酶单酶水解分别提高了9.91%和7.11%。如图6，结果表明，对于鱼溶浆水解，以上5种酶1∶1两两组合混合酶解却对提高鱼溶浆水解度没有任何帮助，NN组水解度显著高于其他各组(P<0.05)。酶解效果的差异可能与原料的性质及不同酶的复合比例有关。

图6 双酶酶解法对水解度的影响P-木瓜蛋白酶，B-菠萝蛋白酶，N-中性蛋白酶，A-碱性蛋白酶，F-复合风味蛋白酶。Fig.6 The influence of compound enzymatic hydrolysis on degree of hydrolysisP-Papain, B-Bromelain, N-Neutral protease, A-Alkaline protease, F-Flavour protease.

3.2 复合酶两步水解

两步酶解法是采用两种或两种以上的酶相继水解底物的方法，可根据不同蛋白酶酶切位点不同，灵活选择不同性质和水解位点的酶，来实现深度水解并提高水解产物质量[24-25]。如图7，两步酶解法水解度较复合酶同步水解水解度有所提高；中性蛋白酶水解1 h，灭酶，分别加入木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶反应3 h，水解度依次为43.19%、41.31%、42.81%、43.38%和42.62%，NB组显著低于其他四组(P<0.05)，而四组间水解度差异不显著(P>0.05)。

图7 两步酶解法对水解度的影响P-木瓜蛋白酶，B-菠萝蛋白酶，N-中性蛋白酶，A-碱性蛋白酶，F-复合风味蛋白酶Fig.7 The influence of two-step enzymatic hydrolysis on degree of hydrolysisP-Papain,B-Bromelain,N-Neutral protease,A-Alkaline protease,F-Flavour protease

4 酸解与酶解

蛋白质水解，即肽键的裂解，可以通过酶或化学方法进行[26]。酸水解最常用的是硫酸水解或盐酸水解，因其水解成本低、反应迅速、水解彻底、可改善食品风味等特点广泛应用于食品领域[27-28]；柠檬酸水解后的酸味相对弱，有助于掩蔽鱼蛋白水解产生的苦味，亦可应用于蛋白水解[29]。本工艺选择了盐酸和柠檬酸对鱼溶浆进行酸解，结果如表5、6所示。

高温高压和酶促水解使蛋白质结构展开，大分子蛋白被降解为小分子量的多肽，同时使游离氨基酸的含量增加[30]。如表5，随着盐酸浓度的升高，水解度不断增加；当盐酸浓度为2%时，3种工艺所得鱼溶浆水解度无显著性差异(P>0.05)；而当盐酸浓度为5%和10%时，酶酸耦合水解工艺所得鱼溶浆水解度显著高于酸解工艺(P<0.05)；此外，鱼溶浆经10%浓度的盐酸酸解后酶解后以10%浓度的盐酸酸解所得水解度与经20%盐酸水解的鱼溶浆水解度相近，说明酸酶两步工艺可以在相对低的酸浓度下实现更好的水解效果。

如表6所示，酶酸耦合水解较柠檬酸酸解工艺提高了鱼溶浆的水解度，当柠檬酸浓度为10%时，鱼溶浆经酶解后酸解，水解度可达(56.71±0.53)%，显著高于酸解工艺(P<0.05)，这一趋势与柠檬酸浓度20%处理组相同。比较表5和表6发现，同一浓度下，盐酸的水解效果优于柠檬酸，鱼溶浆经10%盐酸酸解后酶解水解度最高，为(63.59±2.12)%；另外，酸酶两步水解工艺中酸解与酶解的顺序对水解度几乎没有影响。

表5 酶酸耦合工艺对水解度的影响(盐酸，121 ℃，20 min)Tab.5 The influence of enzymatic acid coupling process on the degree of hydrolysis (hydrochloric acid, 121 ℃, 20 min) %

表6 酶酸耦合工艺对水解度的影响(柠檬酸，121 ℃，20 min)Tab.6 The influence of enzymatic acid coupling process on the degree of hydrolysis (citric acid, 121 ℃, 20 min) %

为了降低工艺难度，在常压下进行水解。在100 ℃，60 min条件下以柠檬酸、盐酸分别水解鱼溶浆稀释液及其1 h酶解液，结果如表7、8所示。相同水解工艺下，随着酸浓度的升高，鱼溶浆水解度均呈现不断升高的趋势，盐酸浓度5%、10%及15%组间差异显著(P<0.05)，而盐酸浓度15%、20%组水解度无显著性差异(P>0.05)；类似的，柠檬酸参与的工艺中，水解度随柠檬酸浓度升高而升高，柠檬酸浓度20%、30%、40%组间水解度差异不显著(P>0.05)。

比较表5、7发现，两种酸解条件(121 ℃，20 min；100 ℃，60 min)可达到相近的水解度；如表7，鱼溶浆经酶解后以15%盐酸酸解，水解度可达(70.21±2.40)%。表6、8的结果表明，同一柠檬酸浓度下，“温度100 ℃，时间60 min”条件下的酸解效果优于“121 ℃，20 min”，仅用20%柠檬酸酸解水解度可达(60.65±0.80)%。综上，酸解条件为“100 ℃，60 min”时可降低工艺难度，有效提高鱼溶浆的水解度。

表7 酶酸耦合工艺对水解度的影响(盐酸，100 ℃，60 min)Tab.7 The influence of enzymatic acid coupling process on the degree of hydrolysis (hydrochloric acid, 100 ℃, 60 min) %

表8 酶酸耦合工艺对水解度的影响(柠檬酸，100 ℃，60 min)Tab.8 The influence of enzymatic acid coupling process on the degree of hydrolysis (citric acid, 100 ℃, 60 min) %

5 结论

本研究通过单因素结合正交试验得到中性蛋白酶酶解鱼溶浆的最佳工艺为：酶解温度50 ℃，初始pH 5，加酶量2 000 U/g，固液比1∶15。该工艺下水解度可达40.37%。

复合酶酶解对水解度影响的研究结果表明，本研究中采用的5种蛋白酶以1∶1(以酶活计)两两复合酶解相较中性蛋白酶单酶酶解不能提高水解度，而以中性蛋白酶和碱性蛋白酶两步酶解水解度可以达到43.38%，较中性蛋白酶单酶酶解提高4.33%。

酸酶耦合水解工艺可以在相对低的酸浓度下可实现更好的水解效果。鱼溶浆经中性蛋白酶酶解1 h后，分别以20%盐酸和20%柠檬酸，在100 ℃条件下水解1 h，水解度可达72.67%和64.67%，在此条件下，水解产物无异味、色泽保持较好，具有作为含高游离氨基酸产品原料的应用潜力。