基于高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱法的苦杏仁与桃仁化学成分差异研究

周 熙，谢 斌，黄晓兰，罗辉泰，黄 芳，谢梦婷，吴惠勤

(广东省科学院测试分析研究所(中国广州分析测试中心)，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东省中药质量安全工程技术研究中心，广东 广州 510070)

苦杏仁是蔷薇科杏属植物山杏(PrunusarmeniacaL.varansuMaxim.)、西伯利亚杏(PrunussibiricaL.)、东北杏(Prunusmandshurica(Maxim.Koehne))或杏(PrunusarmeniacaL.)的干燥成熟种子，具有降气止咳平喘、润肠通便的功效[1-2]。桃仁是蔷薇科樱桃属植物桃Prunuspersica(L.) Batsch或山桃Prunusdavidiana(Carr.)Franch.的干燥成熟种子，具有活血祛瘀、润肠通便和止咳平喘的功效[1,3]。苦杏仁与桃仁在外形上十分相似，尤其是经脱皮、炮制加工后更难区分，实际应用中常被混淆使用。由于苦杏仁的价格相对较低，市场上常出现桃仁中掺入苦杏仁的问题[4-5]。但两种药材的临床功效不同，药材掺假可影响临床效果。

目前，区分桃仁与苦杏仁药材主要采用眼看、 手摸、鼻闻、口尝等传统经验鉴别方法[6-9]，存在主观性强的缺点。DNA测序技术也较多地应用于桃仁与苦杏仁的鉴别[10-11]，但相关技术操作复杂，较难推广。

化学模式识别方法通过统计分析方法，比较研究不同物种、不同基因类型或不同生态类型植物的化学成分，根据定性、定量分析结果找出差异代谢物，广泛应用于药材鉴别及质量评价[12-13]、中药炮制机制[14-15]、天然药物开发[16]等方面。其中，高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF MS)是研究中药中小分子代谢物的主要技术之一。利用HPLC-Q-TOF MS技术的高分辨率、高灵敏度的定性能力和强大的结构表征能力，可对植物化学成分进行定性分析。同时结合化学模式识别方法，可快速寻找化学标志物。目前，苦杏仁与桃仁的化学成分差异研究尚未见报道。本文采用HPLC-Q-TOF MS技术结合化学模式识别方法研究了苦杏仁与桃仁的化学成分差异，可为苦杏仁与桃仁的药效物质基础、质量控制、真伪鉴别等提供科学参考。

1 实验部分

1.1 仪器、材料与试剂

1290 UPLC-6540 Q-TOF MS仪，配置电喷雾离子源、MassHunter 8.0工作站(美国Agilent公司)；赛多利斯 TP-114电子天平(美国Sartorious公司)；KQ2200型台式机械超声波清洗器(东莞市超声波设备有限公司)。α-亚油酸、棕榈酸、油酸(纯度均>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(色谱纯，美国Sigma公司)。8批次苦杏仁与9批次桃仁药材购自广州市清平药材市场。

1.2 样品制备

苦杏仁与桃仁药材粉碎过筛后，精密称取0.5 g于50 mL锥形瓶中，加入10 mL甲醇，称重，超声30 min，甲醇补重，摇匀，静置后以12 000 r/min离心10 min，取上清液待测。质控(QC)样本由制备的样本各取100 μL混合制得。

对照品：α-亚油酸、棕榈酸、油酸各取适量溶于甲醇，用甲醇稀释至50 mg/L。

1.3 色谱条件

色谱柱为Agilent SB-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)；流动相为0.1%甲酸水溶液(A)与乙腈(B)；梯度洗脱：0～2 min，2% B;2～20 min,2%～40% B;20～30 min,40%～90% B;30～45 min,90% B;45.1～50 min,90%～2% B；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；进样量：正离子模式5 μL，负离子模式2 μL。

1.4 质谱条件

Agilent Dual AJS ESI离子源，正、负离子扫描；干燥气(N2)温度为350 ℃；雾化气(N2)压力为2.41×105Pa；干燥气(N2)流量为8 L/min；鞘气温度为350 ℃；鞘气流量为11 L/min；电喷雾电压为3 500 V；毛细管出口电压为150 V；锥孔电压为65 V；八极杆电压为750 V；扫描范围为m/z100～1 000；碰撞能为10、20、40 eV。

1.5 数据分析

1.5.1化学成分定性分析通过一级精确质量数、二级碎片裂解规律以及文献报道的化学成分，同时结合PubChem与Mass Bank在线质谱数据库、安捷伦中药化合物数据库(Agilent TCM PCDL Database)以及对照品对化合物进行确证。

1.5.2差异化合物分析利用Profinder软件进行预处理，包括峰提取、去噪音与峰对齐，得到包含保留时间、质量数和峰强度的三维数据矩阵。将该数据导入SIMCA-P软件进行多元统计分析，包括主成分分析(PCA)与正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，同时利用SPSS软件进行T检验以及倍数差异(Fold change,FC)分析，寻找差异化合物。

2 结果与讨论

2.1 苦杏仁与桃仁的化学成分

按照“1.3”与“1.4”的色谱和质谱条件对苦杏仁与桃仁样品进行分析，其正、负离子模式下的总离子流图见图1。对色谱图中各色谱峰进行精确质量数识别。通过分子离子峰精确质量数、二级谱图等信息，结合文献与化合物数据库，对样品中29个成分进行了鉴定(表1)。结果表明，苦杏仁与桃仁的化学成分相似，主要化学成分种类在两种药材中未发现差别，均存在于苦杏仁与桃仁中。但化合物含量存在一定差异。鉴定的29种化学成分主要包括糖苷类(8个)、氨基酸类(6个)、有机酸类(9个)、其他(6个)。其中，苦杏仁苷、野黑樱苷、扁桃酸酰胺-β-龙胆二糖苷、扁桃酸-β-龙胆二糖苷、扁桃酸-β-D-吡喃葡萄糖苷、苄基-β-龙胆二糖苷等糖苷类化合物是苦杏仁与桃仁主要的难挥发化学成分。丙基-β-龙胆二糖苷首次在苦杏仁与桃仁中鉴定。

表1 苦杏仁与桃仁化学成分的质谱数据及鉴定结果Table 1 Mass spectrometric data and the identification results of constituents in Armeniacae Amarum Semen and Persicae Semen

2.2 差异化学成分分析

PCA是一种无监督的模式识别方式，利用降维算法，将多个指标转化为较少的n个指标，能够真实反映原始数据的分组情况。采用SIMCA-P软件PCA模式对苦杏仁与桃仁的化学成分进行分析(如图2)。结果显示，QC样品聚集明显，说明仪器和方法稳定性良好。PCA模型中，苦杏仁与桃仁可沿t[1]轴分开，说明2种药材的化学成分有明显差异。负离子模式下，1个样品超出PCA空间，可能原因是该样品与其他样品的来源差异较大。不同产地苦杏仁的化学成分具有较大差别[19]。

OPLS-DA作为一种有监督的模式识别方法，将正交信号校正方法与偏最小二乘法结合，通过识别并去除自变量X中与分类变量Y无关的信息，使得分类信息主要集中在1个主成分中，建立高效、稳定的预测模型，有助于筛选差异变量[20]。为进一步找出2种中药材的差异成分，利用OPLS-DA对2组样品进行分析，结果如图3。正、负离子模式下，苦杏仁与桃仁可沿t[1]轴分开，差异化合物明显。R2X(cum)分别为0.815和0.783，R2Y(cum)分别为0.999和0.992。Q2(cum)分别为0.982和0.984，表明模型的可预测准确程度分别为98.2%与98.4%，模型良好。根据变量投影重要性(Variable importance in projection,VIP)>1及T检验中P<0.05 的标准筛选差异化合物。离子强度差异分析是筛查差异化合物的重要方法[12]。对OPLS-DA筛查的差异化学成分的离子强度FC值进行分析，FC值越接近1，说明其差异越小，FC值偏离1越大，说明其差异越明显。如表2所示，OPLS-DA模型共筛查出15个差异化学成分，主要包括糖苷类(丙基-β-龙胆二糖苷、扁桃酸-β-龙胆二糖苷、扁桃酸酰胺-β-D-吡喃葡萄糖苷、苦杏仁苷)、氨基酸(天冬酰胺、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)与脂肪酸(α-亚油酸、油酸、(9Z,11E)-13-Oxooctadeca-9,11-dienoic acid)3类化合物。其中，除天冬酰胺、葡萄糖酸、脯氨酸、扁桃酸酰胺-β-D-吡喃葡萄糖苷、色氨酸等化合物外，其他差异成分在苦杏仁中的含量均较高。

表2 苦杏仁与桃仁的差异化学成分Table 2 Differential compounds between Armeniacae Amarum Semen and Persicae Semen

OPLS-DA模型中，苦杏仁苷对分类贡献最大(VIP=3.70)。苦杏仁苷含量在苦杏仁中显著高于桃仁(P<0.05)。作为苦杏仁与桃仁的特征性成分，《中国药典》规定苦杏仁中苦杏仁苷的含量不得低于2.4%，桃仁中苦杏仁苷的含量不得低于2.0%[1]。与本实验结果一致。在响应差异分析中，苦杏仁苷的FC值为0.77，说明其含量差异较小。若桃仁中掺杂一部分苦杏仁，其浓度变化可能不明显。因此，苦杏仁苷作为鉴别桃仁中掺杂苦杏仁的潜在可能较小。15个差异化合物中仅丙基-β-龙胆二糖苷的含量差异超过10倍(FC=0.03)。说明苦杏仁中丙基-β-龙胆二糖苷的含量远高于桃仁，该化合物可作为潜在的化学标志物用于区分苦杏仁与桃仁2种中药材以及苦杏仁对桃仁的掺混检测。

鉴定的6种氨基酸化合物中有5种在苦杏仁与桃仁中存在显著差异(P<0.05)，推测氨基酸类化合物在2种药材中的代谢存在差异。苦杏仁与桃仁均为植物的成熟种子，油脂类成分是其发挥药理活性的主要成分之一。其中，游离脂肪酸是植物油脂的重要组成部分。3种脂肪酸类化合物的含量在苦杏仁与桃仁中具有显著差异(P<0.05)，且其FC值为0.12～0.16，差异较大，说明苦杏仁与桃仁中的游离脂肪酸含量可能具有显著差异。由于HPLC-Q-TOF MS对油脂类化合物的响应较低，检测到的差异油脂类化合物较少，需在后续对苦杏仁与桃仁的油脂成分进一步分析。

3 结 论

本研究利用HPLC-Q-TOF MS技术鉴定了苦杏仁与桃仁中的29个共有成分。苦杏仁苷、野黑樱苷、扁桃酸酰胺-β-龙胆二糖苷、扁桃酸-β-龙胆二糖苷、扁桃酸-β-D-吡喃葡萄糖苷、苄基-β-龙胆二糖苷等糖苷类化合物是苦杏仁与桃仁主要的难挥发化学成分。结合PCA与OPLS-DA化学模式识别技术，在2种药材中筛查到15个具有显著差异的化学成分。结果表明，糖苷类、氨基酸类与脂肪酸类等3类化合物的含量在苦杏仁与桃仁中具有显著差异，丙基-β-龙胆二糖苷可作为潜在的化学标志物用于区分苦杏仁与桃仁。该文为苦杏仁与桃仁的物质基础及质量标志物研究提供了科学依据。