人体呼出气的分析研究与临床应用进展*

陈然然，宋珍华，吴德华，龙成生，张刘睿祺(公安部南京警犬研究所气味物证实验室，南京210012)

人体呼吸分为吸气和呼气过程，吸气使外部环境空气与肺泡内血液空气屏障处的内部环境交换，外源性化合物扩散到血液后几乎与人体的每个组织接触；呼气过程中，外源性化合物和反映内部身体状况的内源性化合物从血液扩散到呼吸中，通过呼气排出体外。人体的呼出气主要包括氮气、氧气、二氧化碳、水蒸气、惰性气体和数千种微量挥发性有机化合物(VOC)和无机分子(例如NO、NH3和CO等)。在人体呼出气中已鉴定出近3 500种挥发性有机化合物[1]，其是人体中持续发生的代谢、分解代谢和外源性暴露过程的产物，大多数物质都是外源性的，源于环境污染物吸入、食物摄入、皮肤接触和药物代谢等，可反映外界因素对人体健康的影响；来源于人体生理和病理反应随着呼出气体而排出体外的代谢产物VOC包含丰富的生物特征信息，呼吸可作为代谢组学的媒介，呼吸代谢组学可以深入了解人体的所有代谢过程，提供更加全面的身体状况信息。通过呼出气分析可以检测人体呼出气中的代谢产物并监控其变化，用以人体的健康状况评估以及疾病诊断。

人体代谢产物(如VOC)通过血液到达肺部，在肺部进行物质交换后通过呼吸道以呼出气的方式排出体外，人体代谢的异常会导致呼出气中某些成分的变化，进而可通过呼出气诊断的方法来分析判断病情[2]。人体呼出气中的VOC可以揭示各种人体健康状况，相比于传统有创取血检测，呼出气分析诊断具有无创、快速、准确等优点。利用呼出气诊断人体疾病可追溯到古希腊时期，现代呼出气分析研究始于Pauling等[3]通过气相色谱法从人体呼出气中检测到约250种VOC。呼出气中VOC的一种或多种与特定疾病有关，这些VOC被称为疾病的生物标志物(biomarker)。近年来，呼出气分析广泛应用于疾病生物标志物的研究，并发现呼出气中VOC种类和水平的变化与多种疾病存在关联，如糖尿病患者呼出气中异戊二烯、二甲基硫醚、硝酸甲酯、丙酮、丁醇以及一些长链烷烃和苯系物的水平异常[4]；戊烷、苯、苯乙烯、丙醇等均被识别为肺癌的可能标志物[5]；庚酮、戊酮、乙烷、戊烷等被证明与慢性阻塞性肺疾病(COPD)存在显著关联[6]。

目前，呼出气分析在疾病初筛和早期识别中的应用越发受到关注，越来越多的研究证实了呼出气分析在临床诊断、健康监测和环境中VOC暴露评估辅助方面的准确性与重要性。临床和实验室针对人体呼出气的分析研究，主要是检测新技术的研发和疾病生物标志物的发现。人体呼出气通过采气袋、不锈钢容器和吸附捕集器等采集后，或通过固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)[7]或热脱附(thermal desorption,TD)[8]进行预浓缩和富集后，采用基于气相色谱(gas chromatography, GC)或质谱(mass spectrum,MS)、激光光谱和气体传感器的方法进行检测分析[9]。此外，也开展了使用训练有素的嗅探犬进行癌症识别筛查的研究[10]。

目前尚未有关于呼出气中VOC采集、检测、分析、数据处理等标准化操作流程。本文重点综述了人体呼出气的采集及分析技术、呼出气中存在的疾病生物标志物、呼出气分析的临床应用等方面的研究进展，为进一步研究人体呼出气成分、呼出气用于临床诊断和健康监测、呼出气成分与各种疾病的关系等提供借鉴，推动人体呼出气的分析研究进展。

1 呼出气的采集与储存

呼出气的采集和储存应注意保存高挥发性的疾病生物标志物、避免环境VOC的污染，然而，目前人体呼出气的分析研究中缺乏对呼出气采集和分析的标准化。标准有效的采样程序在呼出气分析的科学研究以及临床应用中起着关键作用，其必须考虑两个方面，目标呼出气是总呼吸(生理死腔气和肺泡气)还是肺泡气，及其采样方式[9]。总呼吸采集简单，无需额外设备，但是生理死腔气会稀释呼出气中生物标志物的浓度；肺泡气中外源性污染物浓度较低，其内源性VOC的浓度比总呼吸中高2～3倍[11]。健康个体一次能呼出半升或更多的气体，最初的150 mL是呼吸道的死腔气，没有在肺泡中进行交换，采集呼出气时可除去呼吸的前半部分，以减少死角空气对肺泡空气的稀释和污染[12]。

呼出气采样分为直接和间接两种方式，直接采样为呼出气直接被引入测量系统，间接采样为呼出气存储在一定的介质中或经过预浓缩处理后进行分析。常用的呼出气采集储存介质包括：采气袋(如Tedlar采气袋、Mylar采气袋、Flexfoil采气袋、Nalophan采气袋等)、化学惰性和低放射性塑料材质容器(如注射器等)、玻璃瓶以及装有吸附剂的不锈钢容器和玻璃管(吸附捕集器)，其中Tedlar采气袋、注射器和吸附捕集器应用最为广泛[13]。

通常采用吸附捕集器与采气袋相结合的方式进行呼出气的采集与储存，瑞士杜尔滕生态医疗中心采集呼吸肺泡气的设备示意图如图1所示[14]，该设备通过肺冲洗来清除呼吸过程中吸入的环境污染物使样本污染最小化，自动将呼吸死角空气填充到相应的采气袋中，该袋随后被移除，然后收集肺部的肺泡气，肺泡气储存在惰性气袋或容器中，也可直接转移到分析仪器中，该呼气采集系统已用于多项研究[15-16]。

图1 呼出气收集设备示例[14]

王彤等[17]研究肺隐球病患者呼出气中特征挥发性有机物时，样本采集方式如图2所示，采用鼻吸口呼的方式深呼吸3次，然后用鼻子深吸一口气并屏息10 s后开始吹气，呼出气中的前半段(约5 s)将管路中的废气吹出，后半段(约5 s)采集至1 mL的定量环中，随后进入检测器。此外，谢少华等[18]研究呼出气中VOC对<50岁人群肺结节良恶性的预测价值时，通过采气筒收集口腔呼出气到Tedlar采气袋，并将装有呼出气的Tedlar采气袋置于2～8 ℃下转运，未能及时分析检测时，置于-40 ℃冰箱中保存，并于一周内完成检测。

图2 人体呼气采集示意图[17]

2 呼出气检测技术

呼出气分析作为一种无创且快速的可提供人体疾病状态和治疗结果反馈的测试方法，虽然处于起步阶段，但已引起了科学界和临床医学界越来越多的关注。目前，呼出气分析检测方法主要包括基于GC或MS、激光光谱以及各种气体传感器和气体传感器阵列(电子鼻系统)的方法[9]，对于呼出气中VOC的检测，通常需要基于气体传感器的方法与大型仪器设备相结合来实现对混合VOC中多种成分的同时检测，陈星等[19]构建的基于气相色谱-声表面波传感器联用的中医闻诊系统，通过检测呼出气中的VOC来辨识中医脾胃症候，其集成了大型设备与传感器的优点，气体传感器体积小、能耗低、响应速度快、成本低，可实现现场实时的动态监测，虽然大型仪器设备无法实现现场实时的动态监测，但是能够更准确的检测出混合气体的成分。

2.1基于GC、MS的检测技术 GC用于呼出气中痕量化合物分析时，常与MS、离子迁移谱(ion mobility spectroscopy，IMS)耦合使用[12]。此外，质子转移反应质谱(proton transfer reaction mass spectrometry，PTR-MS)和选择离子流动管质谱(selected ion flow tube mass spectrometry，SIFT-MS)可用于呼吸中痕量气体的实时定量测量[9]。GC-MS技术是检测呼出气中VOC的金标准，尤其是用于疾病生物标志物的全面研究和鉴定，能够定性和定量表征呼出气中与人类疾病相关的生物标志物[20-21]，但是GC-MS和类似分析仪器在临床诊断中的适用性有限。IMS与GC多维色谱柱的耦合可以直接测量人体呼出气中的VOC，具有灵敏度高、分析成本低和数据采集速率高等优点，检测限低，适合临床诊断[17]。PTR-MS技术灵敏度高、相应速度快、可频繁快速测量、检测物质浓度低至ppb，不需要预浓缩和分离程序，在检测VOC方面具有很大的优势[22]；但是该技术只能检测质子亲和力高于水的质子亲和力的化合物，并且无法区分同分异构和同量异位离子，因为它们都是在相同的标称质量下检测到的。SIFT-MS将快速流管技术与质谱定量分析相结合，已被开发用于实时检测和定量分析呼吸样品中的痕量气体[23]，其分析呼出气样品时无需将呼出气收集到袋中或收集器上，可以直接分析单次呼出气，为临床监测提供即时结果。各种检测技术在呼出气分析研究中的应用如表1所示。

表1 基于GC、MS的检测技术在呼出气分析中的应用

2.2基于激光光谱的检测技术 相比于质谱检测，激光光谱检测技术具有高灵敏度、高选择性、实时响应、仪器成本相对低等优点，主要包括可调谐二极管激光吸收光谱(tunable diode-laser absorption spectroscopy，TDLAS)、光腔衰荡光谱(cavity ring-down spectroscopy，CRDS)和光声光谱(photo acoustic spectroscopy，PAS)等，在实验室研究中可以利用激光光谱技术检测呼出气中的生物标志物，但因激光光源成本高、体积大和使用环境等因素限制了家庭使用[9]，基于激光光谱的检测技术在呼出气分析研究中的应用见表2。

表2 基于激光光谱的检测技术在呼出气分析研究中的应用

2.3基于气体传感器的检测技术 气体传感器是目标气体与传感器材料发生吸附或氧化还原等反应，引起传感器材料某些性质发生变化，通过监测响应信号的变化对样本中目标气体进行定性定量分析的小型化装置[35]。相比于实验室大型仪器设备，气体传感器具有的可开发性、测试成本低和小巧易操作等优势，使其在显著降低医疗成本、人体健康监控和环境质量监控等方面具有极大的潜力，此外，针对可穿戴式气体传感器已开展了大量研究，并广泛应用于医疗保健、感官模拟和机器人中[36]。目前气体传感器主要包括比色法传感器、金属氧化物传感器、基于纳米材料的碳纳米管传感器和纳米金属氧化物传感器以及基于半选择性交互式传感器阵列组成的电子鼻系统[9]。比色法传感器可用于指示环境中VOC是否达到允许暴露的浓度限制、是否达到威胁生命和健康的浓度以及显示医疗诊断中的呼吸测试结果等，适于羧酸类、醇类和酯类等活性强的VOC测量，对于芳香烃、氯烃等稳定性强且浓度低的VOC检测较难[10]。金属氧化物传感器具有制造工艺简单成熟、成本低、功耗小、可大量生产和高度小型化等优点，但用于呼出气传感器的金属氧化物存在导电性低、响应和恢复动力学缓慢、目标选择性较弱以及较高的工作温度等缺陷[9,37]。碳纳米管气体传感器对大量的气相分析物均具有敏感性，如NO2、NH3、CH4和H2S等，具有响应速度快、体积小、灵敏度高以及可在室温下工作等优点，在医学界的应用具有广阔的发展前景[9]。将气体传感器阵列与模式识别技术相结合即形成类似生物嗅觉的电子鼻系统[9]，其在多种疾病的(如肺癌、多发性硬化症和慢性肾病)呼出气测试中已使用电子鼻系统[38]。基于各类气体传感器的检测技术在呼出气分析研究中的应用如表3所示。

表3 基于传感器的检测技术在呼出气分析研究中的应用

3 呼出气中与疾病相关的生物标志物

呼吸维持着人体的正常生理活动，人体呼出气中的VOC很多来自于人体内源性的生理和病理反应，呼出气中的一种或多种VOC与特定疾病有关，这些VOC被称为疾病的生物标志物(biomarker)。在医学诊断中被识别为潜在生物标志物的内源性VOC主要包括碳氢化合物(如乙烷、戊烷和异戊二烯等)、含氧化合物(如丙酮、乙醛和甲醇等)、含硫化合物(如二甲基硫醚、甲基硫醇和乙硫醇等)和含氮化合物(如氨、二甲胺和三甲胺等)等，表4中列出了一些与疾病相关的呼出气组分。

表4 与某些疾病相关的呼出气生物标志物

4 人体呼出气在健康监测及疾病诊断方面的应用

4.1碳呼气试验13C呼气试验是检测幽门螺杆菌(helicobacter pylori,HP)感染的金标准。高慧芳等[53]研究结果表明，14C呼气试验检测Hp感染可以比较准确地了解消化道疾病患者的病情情况，有利于疾病进一步的治疗。

王文雅等[54]探讨了健康体检人群13C呼气试验结果与血清胃蛋白酶原水平的相关性，结果显示两者具有一定相关性，在进一步研究基础上，未来部分人群可以仅通过其中一种方法完成健康人群体检筛查。夏伦文等[55]研究表明，14C呼气试验联合胃泌素-17(gastrin-17,G-17)、胃蛋白酶原Ⅰ(pepsinogen-Ⅰ,PG-Ⅰ)、胃蛋白酶原Ⅱ(pepsinogen-Ⅱ,PG-Ⅱ)、PG-Ⅰ与PG-Ⅱ比值(PGⅠand PGⅡ ratio,PGR)对健康体检人群胃息肉具有辅助诊断价值。

白颖等[56]研究表明，呼气试验在胃排空延迟中有较高诊断价值。口服与食物结合的同位素13C，通过检测不同时段13C含量可间接反映胃肠道动力情况。1993年，Ghoos等[57]首先报道了应用13C辛酸呼气试验诊断胃排空延迟的方法，至今在诊断消化系统疾病中已运用数十年。

赖慎伟等[58]研究表明，G-17及14C呼气试验检测对胃癌早期诊断具有较高参考价值，可利于及早采取针对性治疗。此外，吴峰等[59]研究表明，14C呼气试验联合G-17、PGⅠ、PGⅡ检测在早期胃癌筛查中具有重要意义，可为胃癌早期诊断提供有效依据。

4.2呼气末CO2分压监测 呼气末CO2是一项可表征人体肺部通气、代谢状态和循环功能等情况的非常重要的生理参数，也是临床检查的重要指标。呼气末呼出气中CO2的浓度即呼气末二氧化碳分压(PetCO2)，其与动脉血二氧化碳分压(PaCO2)有一定的相关性，监测PetCO2可用于评估心肺复苏质量、辅助呼吸内科疾病诊断与疗效评估、麻醉监护等，是一种直观、操作简单快捷的无创监测技术。美国麻醉师协会(ASA)、美国呼吸治疗协会(AARC)及美国心脏协会(AHA)均将CO2监测作为一种常规的监测项目。

AHA心肺复苏指南指出，PetCO2可反映心脏骤停患者实施心肺复苏过程中的心排血量和心肌灌注，用以优化胸外按压质量及指导血管加压药物治疗。研究表明，COPD、哮喘和肺炎等患者呼出气中CO2的含量与健康个体差异较大[60]。PetCO2可以用来排除肺栓塞[61]和评估COPD患者的呼吸衰竭程度[62]，在COPD患者加重期，PetCO2与PaCO2的差值(ADCO2)是评价病情严重程度的有效指标。ASA推荐手术过程中常规监测PetCO2来指导通气量的调节，如连续监测PetCO2在及早发现新生儿急腹症手术静脉麻醉过程中呼吸功能变化时具有很高的可信度和准确度。

4.3呼气峰流速监测 呼气峰流速(peak expiratory flow,PEF)是指研究对象从用力吸气到不能再吸入的位置(被称为肺总量)开始用力呼气过程中，最初100毫秒所能达到的最高呼气流速(量)。PEF监测是一种简易的肺功能检测手段，能够反映呼吸道气流阻塞的程度，可用来预测哮喘急性发作、评估药物疗效及急性加重后的恢复情况。陈春雨等[63]探索了肺癌患者肺叶切除术前PEF对术后肺部相关并发症(PPC)的临床预测价值，结果表明低PEF值与肺癌患者肺叶切除术后PPC的发生有关，是PPC的独立预测因子。研究表明，心血管疾病风险及其相关发病率和死亡率与肺功能的减退和PEF的减退相关；国外研究发现，PEF可预测个体未来的住院率和死亡率，可作为评估个体健康状况及风险预测的工具[64]；国内研究发现，PEF与呼吸系统疾病、心血管疾病和肺癌死亡率呈负相关[65]。研究表明，可以将PEF指标纳入China-PAR预测10年心血管疾病患病风险公式中，进一步筛查心血管疾病高危人群[66]。

4.4嗅探犬用于癌症识别 犬有可能发现癌症的报道分别发表于1989年[67]和2001年[68]，未经训练的犬自发识别到其主人身上的恶性黑色素瘤。从此，一些研究中心针对这方面开展了研究和测试，试图通过训练有素的犬嗅闻人体组织、尿液或呼出气等不同检材，来识别不同类型的癌症(如肺癌、卵巢癌和结肠癌等)。

近年来，开展了大量利用训练有素的嗅探犬识别人体呼出气中癌症的生物标志物，Rudnicka等[25]使用训练有素的嗅探犬识别肺癌患者、健康志愿者和其他肺部疾病患者的呼出气，并与采用SPME/GC-MS技术对这些呼出气样本定性和定量结果进行比较，来评估嗅探犬气味检测的敏感性和特异性，结果显示，犬针对这些呼出气样本检测的敏感性为86%、特异性为72%。因此，将来使用嗅探犬进行气味检测有可能实现快速、无痛且无创的癌症诊断。

Jezierski等[69]研究表明，训练有素的犬能够以“比偶然性好”的概率区分出肺癌和其他癌症患者的典型呼吸气味样本与健康人的典型呼吸气味样本，犬检测的适应性与呼吸气味样本中2-戊酮和乙酸乙酯的含量呈正相关，与1-丙醇和丙醛的含量呈负相关。此外，McCulloch等[70]研究表明呼出气样本储存几周后，嗅探犬仍能区分癌症患者和健康志愿者的呼出气样本。

犬气味鉴别作为潜在的癌症筛查方法，具有无创性、呼出气采样和储存简单、易于检测和结果简单明了以及检测成本较低等优势，但是该方法不能确定犬对呼出气中哪种或哪些物质反应，尚不能确定嗅探犬是否能以与嗅出已经确诊病例大致相同的准确度嗅出临床癌症早期。为了实现利用犬在人群中进行实际的癌症筛查，必须通过大量的实验来评估，利用犬区分出确诊的癌症病例与健康人的呼出气样本并不是最终目标，未来利用嗅探犬进行癌症筛查和预防对人类具有重要的意义。

5 展望

人体呼出气中包含丰富的生理和疾病的生物特征信息，呼出气组分的检测有助于深入了解人体内的所有代谢过程，提供生物体状况的全面信息用于健康评估，以及依据生物标志物进行疾病诊断。目前，已发现人体呼出气中包含多种疾病的生物标志物，如肺癌、乳腺癌和糖尿病等，然而针对各种生物标志物的来源、分布和生化途径的研究仍处于初步阶段，其与疾病的确切关联性尚不清楚；同时不同个体之间特定VOC的差异取决于各种因素，如生理状态、饮食习惯、呼出气采集及储存方式方法、检测技术和操作人员造成的各种误差等，尚未发现某种VOC只与一种疾病有关联。总的来说，目前尚未有关于呼出气中VOC采集、检测、分析、数据处理等标准化操作流程，未来我们可逐步实现呼出气采集和分析的标准化，推进呼出气分析在人体健康监控、疾病诊断和环境VOC暴露风险等方面的应用进程。此外，针对呼出气中疾病生物标志物的研究，仍需进行大量研究、增加样本量、提高分析仪器灵敏度，以获得更加准确的呼出气VOC表征，找出呼出气中更加确切的疾病生物标志物。

目前，科学界和临床医学界针对呼出气的研究主要疾病生物标志物的发现和检测新技术的研发。针对呼出气的分析，进行实验室测量的大型仪器如GC-MS，配合固相微萃取和热脱附等前处理方法，能够全面的定性和定量分析呼出气中的VOC，可以同时分析呼出气中多种VOC的准确水平及在人群中的差异，快速确定与疾病相关的特异性VOC，但其操作难度高、专业性强、设备体积大、分析时间长、成本高等，不适用于现场实时的动态监测和低成本的快速疾病筛查，在临床应用中的适用性有限。相比之下，基于气体传感器或传感器阵列的设备具有可开发性、小巧易操作和成本低等巨大优势，其在显著降低医疗成本、人体健康监控和疾病诊断方面具有极大的潜力，未来可穿戴式的基于传感器或传感器阵列的设备将能够实时监控人体的健康状况。然而基于气体传感器或传感器阵列的设备无法提供有关呼出气成分的信息，通过目标气体与传感器的一系列反应来识别呼出气中的目标化合物，很大程度上依赖于各种算法和广泛的数据处理，因此需要结合大型仪器设备来实现混合VOC中多种成分的同时检测。此外，已有研究证明嗅探犬能以“比偶然性好”的概率区分出肺癌和其他癌症患者的典型呼吸气味样本与健康人的典型呼吸气味样本，未来利用嗅探犬通过气味检测实现快速、无痛且无创的疾病筛查与诊断具有极大的潜力。

随着呼出气检测技术的不断革新和科研人员对人体呼出气奥秘的不断探究，未来可发现人体呼出气中各种与疾病相关的VOC生物标志物，建立其与疾病的确切关联，呼出气分析将用于可穿戴式的基于传感器或传感器阵列的设备实时监控人体的健康状况以及成为医疗领域一种无创、快速、更加准确的疾病诊断方法，同时实现利用嗅探犬在人群中进行实际的疾病筛查。