番茄红素在大鼠电离辐射后氧化应激反应中减轻晶状体损伤的作用△

陈月芹 刘聪 刘璟禹 高颖 梁威宁 李奕泽 薛春燕

随着核能与核技术的迅速发展，电离辐射(IR)已被广泛应用于各个领域，人类在享受这些便利的同时暴露于IR的风险也日益增加[1]。晶状体是机体对IR最敏感的组织之一，IR会引起放射性白内障发生[2]。白内障是世界上首要的致盲眼病，目前除手术治疗外，缺乏有效的针对其潜在机制的预防和治疗方法。据估算，在全球范围内如果能使白内障的发病时间延迟10年，其手术需求量将减少50%，从而提高了此类患者的生活质量，同时可减少由于白内障致视力障碍和手术费用所带来的经济损失约1000亿美元[3-4]。因此，研究和发现预防和延缓放射性白内障的非手术方式意义重大。

IR使机体产生大量活性氧(ROS)，引起晶状体氧化应激损伤，导致白内障的形成[5]。有不少研究表明，番茄红素(LYC)能够有效地清除体内ROS发挥抗氧化能力[6-7]。本研究旨在探索LYC对大鼠X线照射后体内氧化应激的调节作用及其对晶状体辐射损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠30只，体质量(170±10) g，购自东部战区总医院比较医学科。所有大鼠一般情况良好，毛色光泽，活动自由，纳入实验前检查排除晶状体异常。自然采光、饮食，适应性饲养1周后开始实验。本实验通过东部战区总医院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂与仪器主要试剂：LYC购自南京远见生物工程有限公司；橄榄油购自上海麦克林生化科技有限公司(货号：C10005904)；丙二醛(MDA)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、DAPI染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。主要仪器：瑞典医科达Precise全数字化高能直线加速器(编号：22030040)、离心机(盐城凯特实验仪器有限公司)、台式恒温振荡器(上海精宏实验设备有限公司)、光学及荧光显微镜(日本奥林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 药物配制将LYC粉末溶于橄榄油中，现配现用。

1.2.2 动物分组大鼠随机分为：正常对照组、IR组、LYC低剂量组(5 mg·kg-1)、LYC中剂量组(10 mg·kg-1)、LYC高剂量组(15 mg·kg-1)，每组各6只。除正常对照组外，其余4组均由东部战区总医院放疗科通过医用直线加速器以X线一次性照射41 s，总剂量2 Gy。辐照后，正常对照组和IR组大鼠橄榄油灌胃，LYC各剂量组大鼠灌胃等剂量LYC，连续灌胃24 d。实验期间大鼠自由摄食饮水。

1.3 氧化应激指标检测大鼠灌胃24 d后，取尾静脉血5 mL，静置30 min后，低温(4 ℃)3000 r·min-1离心15 min，分离得血清，根据试剂盒的操作步骤，测定大鼠血清MDA、SOD、T-AOC水平。

1.4 组织病理学观察大鼠灌胃24 d后，50 g·L-1水合氯醛腹腔注射麻醉，用量为每100 g体质量0.7 mL，麻醉后将大鼠脱颈处死。摘取大鼠眼球，固定(体积分数10%中性福尔马林)24 h后，梯度浓度乙醇脱水、石蜡包埋、切片(厚度5 μm)、染色，于光学显微镜下观察并摄片(×400)。

1.5 TUNEL检测细胞凋亡将石蜡切片脱蜡复水；蛋白酶K于37 ℃反应30 min，PBS洗涤3次；滴加50 μL脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)缓冲液，盖上塑料盖玻片，湿盒避光于37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次；滴加50 μL 异硫氰酸荧光素标记链亲和素(FITC)，避光湿润37 ℃反应30 min，PBS洗涤3次；最后滴加DAPI室温下避光染核5 min，抗荧光淬灭封片剂封片，使用荧光倒置显微镜于200 倍镜下观察。显微镜下随机选取5个不同视野，计算TUNEL指数，TUNEL指数=TUNEL阳性细胞数/总细胞数×100%。TUNEL阳性细胞：细胞核发绿色荧光。

1.6 统计学方法运用软件SPSS 17.0进行统计分析，数据以均数±标准差表示，常规进行方差齐性检验，多组资料之间的比较采用One-way ANOVA方差分析，组间比较采用LSD法。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠血清氧化应激指标辐照后，IR组大鼠血清SOD、T-AOC水平均低于正常对照组，大鼠血清MDA水平高于正常对照组(均为P<0.05)。虽然LYC低剂量组大鼠血清SOD、T-AOC水平均较IR组升高，大鼠血清MDA水平较IR组降低，但差异均无统计学意义(均为P>0.05)；LYC中、高剂量组大鼠血清SOD、T-AOC水平均高于IR组，大鼠血清MDA水平均低于IR组(均为P<0.05)。与LYC低剂量组相比，除了LYC高剂量组大鼠血清T-AOC水平升高(P<0.05)外，LYC中、高剂量组大鼠血清其余各指标差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与LYC中剂量组相比，LYC高剂量组大鼠血清SOD、T-AOC、MDA水平差异均无统计学意义(均为P>0.05)。与正常对照组相比，LYC低剂量组大鼠血清SOD、T-AOC水平均下降，大鼠血清MDA水平上升(均为P<0.05)；LYC中、高剂量组大鼠血清SOD、T-AOC、MDA水平与正常对照组相比，差异均无统计学意义(均为P>0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠血清SOD、T-AOC、MDA水平比较

2.2 各组大鼠晶状体组织病理学变化正常对照组大鼠晶状体上皮细胞(LECs)、纤维细胞排列整齐且致密，晶状体弯(lens bow)结构清晰；IR组大鼠晶状体结构受损：LECs排列稍稀疏，晶状体纤维细胞水肿，晶状体内后囊下出现空泡(黑色箭头)，晶状体弯结构稍紊乱；LYC低、中、高剂量组大鼠能改善晶状体结构的损害，随着LYC剂量的升高，晶状体组织结构逐渐恢复正常，LECs排列趋于整齐致密、晶状体纤维水肿减轻、后囊下空泡减少(图1)。

图1 HE染色检测各组大鼠的晶状体组织形态(×200)。黑色箭头示后囊下空泡；黄色箭头示上皮细胞；绿色箭头示晶状体弯。

2.3 各组大鼠LECs凋亡TUNEL检测结果显示，正常对照组、IR组、LYC低剂量组、LYC中剂量组、LYC高剂量组大鼠TUNEL指数分别为(1.47±0.50)%、(24.08±5.17)%、(22.19±0.80)%、(11.69±1.69)%、(8.49±1.97)%。正常对照组大鼠LECs存在极少量凋亡；与正常对照组相比，X线照射后IR组大鼠LECs凋亡明显增加(P<0.05)；与IR组相比，LYC治疗能够减少LECs的凋亡，其中以LYC中、高剂量组效果明显(均为P<0.05)；LYC低剂量组大鼠LECs的凋亡虽然比IR组低，但差异无统计学意义(P>0.05)；与LYC低剂量组相比，LYC中、高剂量组抑制细胞凋亡作用更强(均为P<0.05)；LYC高剂量组大鼠LECs比LYC中剂量组抑制效果更佳(P<0.05)。虽然LYC能抑制辐射引起的细胞凋亡，然而与正常对照组相比，LYC低、中、高剂量组LECs凋亡均上升(均为P<0.05)(图2)。

图2 TUNEL检测各组大鼠LECs凋亡(×200)。A：正常对照组；B：IR组；C：LYC低剂量组；D：LYC中剂量组；E：LYC高剂量组。绿色荧光为TUNEL阳性细胞。

3 讨论

辐射技术已广泛应用于现代医学，医疗照射(影像检查、肿瘤治疗等)已成为除天然源照射外最大的IR来源[8]。机体ROS水平升高是IR引起损伤的重要机制之一[9]。SOD可以清除ROS并减轻ROS对机体的损伤，其水平高低是反映机体抗氧化损伤能力的强弱。MDA是脂质过氧化反应的产物，其水平高低是反映机体氧化损伤的重要标志[10]。T-AOC反映体内总的抗氧化能力[11]。LYC是广泛存在于红色水果和蔬菜中的一种类胡萝卜素，因其分子中含有11个共轭及2个非共轭的碳-碳双键，可以通过物理和化学两种方式高效地淬灭单线态氧和清除自由基，其抗氧化能力远高于其他类胡萝卜素[6]。本研究发现，X线照射后大鼠体内MDA水平升高，T-AOC、SOD水平降低。IR能够引起机体组织SOD等抗氧化酶水平降低、组织抗氧化能力下降，从而导致脂质过氧化、MDA水平升高造成组织氧化损伤[12]。本研究还发现，LYC灌胃后能逆转以上指标的变化，其中以中、高浓度作用明显。LYC能够减轻X线照射引起的氧化应激损伤，LYC的保护作用与国外学者研究结果相似[13-14]，LYC能够增强机体的抗氧化能力，减轻机体的氧化损伤。

国际辐射防护委员会(ICRP)将晶状体损伤归为辐射的确定性效应。在我国职业性放射性疾病确诊病例分布中，放射性白内障长期以来高居第2位，占23.4%[15]。晶状体由囊膜、皮质、核以及前囊下一层LECs组成。LECs可分化成为晶状体纤维构成晶状体的主要部分，晶状体纤维分化以及排列的有序进行保证晶状体的透明性以及功能。LECs在分化成晶状体纤维的过程中，细胞核的轨迹形成一特殊结构，称为晶状体弯，分化过程中发生异常可导致这一结构的异常和白内障的发生[16]。放射性白内障早期，裂隙灯下最常见的是后极部后囊下出现小泡或点状混浊，并逐渐扩大，在其周围可再出现颗粒或小泡，直径达数毫米[17]。ROS引起的氧化应激是白内障发生的共同因素。当晶状体遭遇的氧化应激超过其氧化防御能力时，LECs发生凋亡，晶状体蛋白发生氧化、变性、聚集最终引起晶状体混浊形成白内障[5]。本研究中X线照射后大鼠晶状体后囊下出现空泡、LECs排列稍稀疏、晶状体纤维细胞水肿、晶状体弯形态稍紊乱。Morita等[16]研究也发现，X线照射导致大鼠LECs密度、排列异常，晶状体皮质纤维肿胀，晶状体弯结构异常。TUNEL检测结果显示，X线照射后引起LECs凋亡，Morita等[16]通过在体实验也发现X线能引起LECs的减少。也有不少研究者通过体外实验研究结果表明，IR能够引起LECs的凋亡[17]。本研究还发现，LYC能够改善X线照射引起的晶状体结构的损伤，减少LECs的凋亡。这与国外学者研究结果相似[14，18]，LYC能够抑制细胞凋亡减轻氧化应激对组织的损伤。

综上所述，LYC可以调节大鼠IR后的氧化应激状态，减轻IR对晶状体的损伤，有望将其开发为预防、延缓放射性白内障发生的药物。