中华绒螯蟹免疫增强剂的研究进展

吕孙建 焦锦彪 袁雪梅 于喆 张海琪 杭小英 施伟达 吴颖蕾

摘要：近年来，水产养殖病害频发，抗生素和化学消毒剂滥用现象日益严重，对养殖水环境和人类安全都存在巨大威胁。免疫增强剂作为一种新的药物类型，其主要作用是激活机体的免疫系统，提高机体特异性免疫和非特异性免疫，从而增强机体抗病原微生物感染的能力，是一种有望取代抗生素的有效方法。本研究主要以近年中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）免疫增强剂的研究和应用现状为基础，从微生物及其多糖、动植物多糖及提取物、人工合成的化学物质和营养元素等几类免疫增强剂对中华绒螯蟹的免疫、抗病力、抗氧化及生长代谢等重要功能研究现状进行总结分析，為中华绒螯蟹免疫增强剂的科学合理使用提供了重要的参考依据，以期达到中华绒螯蟹健康养殖的发展目标。

关键词：中华绒螯蟹;免疫增强剂;免疫力;抗氧化;抑菌

中图分类号： S963.73+6  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2021）10-0019-05

中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）属甲壳纲、十足目方蟹总科，弓蟹科的一属，又称毛蟹、河蟹，广泛分布于中国境内南北沿海各地湖泊、河流。中华绒螯蟹具有个体大、生长快、食性杂、易饲养、病害少等养殖性能优势，同时因其肉味鲜美、富含低胆固醇蛋白质，作为营养保健食品而风靡全国，其市场前景广阔。20世纪70年代起，中国开始利用天然海水或人工海水进行中华绒螯蟹人工育苗，并在繁殖生物学、自然水温育苗等方面进行了初步研究，目前，中华绒螯蟹在浙江、江苏等地有大量养殖，其2018年的养殖产量达到756 877 t[1]。但同其他淡水养殖品种类似，近年来，随着养殖规模的不断扩大，各种疾病频发，导致中华绒螯蟹养殖业受到巨大的挑战。中华绒螯蟹病害防控的传统方式以使用抗生素和化学类消毒剂等为主，一方面导致耐药菌频现，另一方面又对养殖环境造成极大的破坏。中华绒螯蟹病害发生是机体、病原与水环境三者相互作用的结果，在正常的养殖水环境，直接控制病原的手段受限，增强蟹机体本身的免疫力是解决其养殖病害问题的重要举措。已有的研究结果表明，有多类免疫增强剂能够激活中华绒螯蟹的免疫系统，包括微生物及其多糖、动植物多糖及提取物、人工合成的化学物质和营养元素等。本研究就近年来常用免疫增强剂对中华绒螯蟹免疫系统和抗病能力影响的研究现状进行综述，以期寻找最合适的中华绒螯蟹免疫增强剂，为其养殖业的健康发展提供参考。

1 微生物及微生物多糖

1.1 微生物多糖

多糖是由多个单糖分子失水缩合，通过特定糖苷键按照一定顺序连接而成的线性或分支的聚合物，是一类分子结构复杂的生物大分子，广泛存在于动物、植物和微生物中，具有多种生物学活性。其中，微生物多糖是由细菌和真菌等微生物所生产的多糖，相对其他多糖具有生产周期短、成本低廉、无污染，可进行大规模工业化生产（纯度高、纯化简单）等优点。胡火庚等研究发现，酵母复合物（主要为β-葡聚糖、α-甘露聚糖肽、肽类及蛋白质和几丁质）和酵母提取物均能显著提高中华绒螯蟹的非特异性免疫，表现为各组织器官中PO、AKP、ACP、LZM和Ua等活性显著上升，抗氧化能力增强[2-3]。Lu等也发现，饲料中添加甘露寡糖可提高中华绒螯蟹肠道中PO、AKP和ACP等酶的活力，其中额外添加1.5 mg/kg β-葡聚糖对酶活的提升作用最为明显，另外还促进了抗菌肽以及proPO、Peritrophin、p38MAPK、LITAF、Relish等基因的表达量[4]。此外，连续投喂含酵母细胞壁的饲料还可以有效增强中华绒螯蟹的抗细菌感染能力，经口服感染和注射感染“颤抖病”阳性病原后，酵母细胞壁对中华绒螯蟹细菌感染保护的有效率分别达到了52.4%～66.8%和39.2%～49.9%[5]。

1.2 细菌及真菌

部分细菌因细胞壁中含有肽聚糖和脂多糖等细菌多糖，灭活后常被用于激活动物机体的免疫系统[6]。嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）是水产常见的条件致病菌，在各类养殖水体中广泛存在[7]。当养殖水体水质恶化或其他环境因子发生改变时，嗜水气单胞菌数量会急剧增加，可引起中华绒螯蟹爆发“腹水病”和“甲壳溃疡病”等疾病[8]。程超等发现用嗜水气单胞菌刺激可引起中华绒螯蟹组织结构发生改变，如鳃丝增厚、血细胞数量增多、肝小管管腔比面积和结构、细胞数量发生显著变化[9]。另外，注射嗜水气单胞菌还可提高肝胰腺ALF、HSP、Crus1、FABP3、DOME和STAT等基因的表达水平[8]。刘永贵等发现用含嗜水气单胞菌海藻酸钠微胶囊冻干疫苗的饲料饲养中华绒螯蟹可显著提高其SOD、PO和LZM等酶的活性，并且其对嗜水气单胞菌的抵抗力也明显增强[10]。沈锦玉等也发现，灭活嗜水气单胞菌可提高SOD、PO和LZM等酶的活性，其中注射免疫较口服免疫对蟹的免疫保护率更高，达75%[11]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对水产养殖中病原微生物有很强的抑制作用，能分泌大量几丁质酶，分解养殖池中的有毒有害物质，同时能分解池中的残饵、粪便、有机物等[12]。枯草芽孢杆菌也被广泛应用在饲料中，它具有较强的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性，能促进饲料中营养素的分解，使水产动物对饲料的吸收利用更加充分[13]。陈文典等发现，基础饲料中添加 1.5 g/kg 枯草芽孢杆菌微胶囊冻干粉（2.2×1011 CFU/g）可提高中华绒螯蟹的PO和LZM活性，使其对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强[14]。同样高活性干酵母也能够提高中华绒螯蟹对病原感染保护的有效率[15]。

2 动植物多糖及其他提取物

2.1 动物多糖

壳聚糖又称可溶性甲壳素、甲壳胺、几丁聚糖等，广泛存在于虾、蟹等甲壳动物及藻类和细菌中，是世界第二大类高分子化合物[16]。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化反应转化变成的分子量为12万～59万的生物大分子，具有可生物降解、代谢产物无毒性和调节机体多种生理功能等优点[16]。研究结果证实，在饲料中添加50 mg/kg壳聚糖，不仅可降低中华绒螯蟹肌肉和可食内脏中粗脂肪含量，还能提高SOD、PO、AKP和CAT等酶活性，促进蟹淋巴细胞的增殖[17]。生产性试验同样证实了壳聚糖能够提高中华绒螯蟹的成活率[11]。

2.2 植物多糖

用于水产动物的植物多糖主要包括黄芪多糖、云芝多糖、低聚果糖、海带多糖、海藻酸钠和枸杞多糖等[6]。低聚果糖广泛存在于通常食用的很多水果、蔬菜中，能够选择性促进乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌等有益菌在消化道中的定植，抑制有害细菌生长、改善肠道菌群、间接达到对动物体的营养及促生长效应[18]。Jia等证实，低聚果糖不仅能够提高中华绒螯蟹CAT、ACP和AKP等酶的活性，还能显著促进mtMnSOD、LITAF和TLRs等免疫基因的表达[19]。黄芪多糖同样也被证实能够提高中华绒螯蟹多种免疫相关基因的表达量，包括ALF、PO、HSP、Crus1、TLRs、EsFABP3、JAK、DOME和STAT等[8]。另外，飼料中添加海带多糖也能提高中华绒螯蟹SOD、PO和LZM等酶的活性[11]。海藻酸钠是一类从褐藻类（如海带、巨藻、马尾藻等）的细胞壁中提取出来的天然多糖，按10、30、90 mg/kg剂量注射藻酸钠均可显著提高中华绒螯蟹血细胞总数、大颗粒细胞数量、血细胞吞噬活性、呼吸暴发活性和对嗜水气单胞菌的抵抗力，且海藻酸钠饲喂组PO和LZM等酶的活性也显著地高于对照组[20]。

2.3 多酚

α-苯基苯并吡喃是从分布较为广泛的一种植物中提取的多酚类物质，具有较强的生物学活性，能够有效激活动物的免疫系统，且具有无毒副作用、无残留、不产生耐药性等优点，因而成为水产甲壳类动物的免疫增强剂[21]。研究发现，饲料中添加4 mg/kg α-苯基苯并吡喃可显著地提高中华绒螯蟹血淋巴细胞中PO、LZM和SOD等酶的活性[21]。

2.4 谷胱甘肽

谷胱甘肽是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，存在于几乎身体的每一个细胞，能帮助保持正常的免疫功能，并具有抗氧化和整合解毒作用[22]。Liu等发现，饲料中添加谷胱甘肽不仅可以提高中华绒螯蟹肝胰腺SOD、GSH-Px、Glutathione S-transferase、GST的活性和基因表达量，还可以显著减轻因脂多糖刺激引起的肝胰腺损伤，减少肝胰腺中活性氧自由基和细胞凋亡指数[23]。谷胱甘肽添加，主要抑制了Caspases-3、Caspases-8、Caspases-9等酶活性及Caspases-3、Caspases-8等基因的表达量，并促进bcl-1和bax-inhibitor基因表达量[23]。Liu等进一步研究发现，添加谷胱甘肽除能够显著提高SOD、LZM、ACP、AKP等酶的活性外，还可以降低血淋巴和肝胰腺中的MDA水平[24]。另外，细胞内MnSOD、mtMnSOD、Cu，Zn-SOD、GSH-Px、LZM、proPO活化因子等基因的表达量显著上调，而TLR1、TLR2、Dorsal和MyD88等基因的表达量则显著下调[24]。

2.5 精氨酸

精氨酸是水生动物的一种必需氨基酸，具有广泛的生物功能，它不仅是合成蛋白质的重要氨基酸之一，也是合成多胺、肌酸和NO的前体物质[25]。精氨酸与免疫功能密切相关，可被分解为NO参与免疫反应。有研究表明，精氨酸可提高中华绒螯蟹肝胰腺中SOD和CAT等酶的活力，提高肝胰腺KEAP1基因的表达量，从而提高机体的抗氧化能力[26]。另外，精氨酸还可降低血清中NO的含量和肝胰腺NO合成酶的活性，提高ACP和AKP等酶的活力，且Crustin、Relish、LZM、Cryptocyanin的mRNA表达量也有显著上升[26]。

2.6 牛磺酸

牛磺酸是一类广泛存在于生物体中的β必需氨基酸[27]，在水产动物体内扮演着非常重要的角色[28]，如抗氧化[29]、免疫调节[30]、渗透压调节[31]、解毒[32]、神经调节[33]和肠道微生态调控等[33]。Dong等发现，添加微量牛磺酸可特异性增加中华绒螯蟹血细胞总数，并提高ACP、PO、LZM和AKP等酶的活性，其抗氧化能力相关指标，包括SOD、GSH-Px、T-AOC活性和MDA含量也显著提升。另外，牛磺酸还可以上调中华绒螯蟹的免疫基因（TLR2和Relish）和抗菌肽蛋白基因（EsALF1、EsALF2、EsCrus1和EsCrus2）[34]。

2.7 抗菌肽

抗菌肽是一类具有抗菌活性的小分子多肽的总称，是天然免疫防御系统的重要组成部分，在机体抵御病原微生物的过程中发挥着重要的作用[35-36]。抗菌肽具有广谱杀菌作用，不仅对革兰氏阳性菌和阴性菌有杀灭作用，对部分病毒和寄生虫也有明显抑制效果，而且抗菌肽还能够提高机体的免疫功能。因此，抗菌肽被认为是替代水产抗生素的潜在产品，具有巨大的应用潜力[35]。Guo等发现，抗菌肽As-CATH4和As-CATH5对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌等水产常见致病菌有明显抑制效果，能够减少中华绒螯蟹体内感染的细菌数量，降低死亡率[37]。另外，该抗菌肽还能够特异性提高中华绒螯蟹ACP和AKP等酶的活性[37]。王一娟等也发现，饲料添加0.4%的抗菌肽能显著降低血清GPT、球蛋白及肝脏、肌肉和性腺中的MDA浓度，提高肝脏和肌肉组织中SOD的酶活性以及T-AOC[38]。

2.8 中草药

中草药富含多糖、甙类、生物碱、苦味素、生物类黄酮等多种有效成分，不仅可以提高营养物质的利用效率、增强机体新陈代谢、促进机体生长，还能调节机体内的免疫功能，并且拥有价格低廉、来源丰富、不易污染环境等优点，因而已成为水产养殖中非常适宜的免疫增强剂[39-40]。周永昌等发现，饲料中添加复方中草药（甘草、人参、绞股蓝、银杏叶）显著提高了雄蟹血清ACP和肝胰腺T-AOC、SOD、AKP等酶活性，降低了MDA含量，而雌蟹免疫力提高主要表现为血清ACP、AKP和肝胰腺SOD酶活性的提升[41]。同样地，许振国等发现，在基础饲料中添加复方中药免疫增强剂（板蓝根、老鹳草、黄芩、黄芪、鱼腥草、连翘、陈皮）可提高中华绒螯蟹免疫因子的活性及血细胞的吞噬功能[42]。此外，由海藻多糖、大黄、黄芪和连翘组成的复方中草药也能显著提高中华绒螯蟹的血细胞吞噬活性、血清杀菌活力、血清凝集效价及抗感染能力[43]。金银藤则能够提高中华绒螯蟹血细胞总数和LZM、PO、NOS等酶的活性，并能够进一步提升血细胞对嗜水气单胞菌的吞噬率和吞噬指数[44]。

3 人工合成的化学物质

人工合成的化学类免疫增强剂主要包括左旋咪唑、二氧化铈和KF-565等。左旋咪唑因具有类似胆碱的活性，能够诱导机体的淋巴因子，且代谢产物能够清除氧自由基，因而被用于开发饲料添加用免疫增强剂[45]。李义等发现，左旋咪唑可以大幅提高中华绒螯蟹的血细胞总数和透明细胞数量，且细胞的吞噬百分率、呼吸爆发和PO、LZM等酶的活性均有一定提高，其对嗜水气单胞菌的抵抗力也有显著增强[46]。类似地，二氧化铈也具有很强的免疫促进作用，主要表现为显著提高机体的抗氧化能力[47]。Qin等发现，饲料中添加0.8 mg/kg的二氧化铈可有效减轻中华绒螯蟹的肝胰腺伤，提高血细胞总数、颗粒细胞和透明细胞的数量，提高血淋巴中LZM、ACP、AKP、SOD和CAT等抗氧化酶的活性及Cathepsin-L的基因和蛋白表达量[48]。

4 营养元素

维生素是水产饲料重要的功能性成分，可以增强机体的特异性和非特异性免疫应答，提高动物的抗病力，其中，维生素C还能够清除机体吞噬作用和呼吸爆发产生的氧自由基，避免机体受到氧化损伤，提高细胞吞噬活性和杀菌能力[49]。维生素C在中华绒螯蟹养殖业中也有一定应用，如艾春香等发现饲料中添加维生素C可提高中华绒螯蟹组织器官中PO、LZM、Ua、AKP和ACP等酶的活性，而SOD活性显著降低，这意味着维生素C作为天然抗氧化剂既能提高中华绒螯蟹非特异性免疫力又能提高其抗氧化能力[50]。维生素E同样也被艾春香等证实能够提高中华绒螯蟹的非特异性免疫力[51]。

综上，目前可用于中华绒螯蟹的免疫增强剂种类繁多、功能多样，随着中华绒螯蟹免疫机理的不断深入研究，特异性提高中华绒螯蟹免疫力的免疫增强剂的种类有望得到进一步的开发和应用。免疫增强剂将会逐渐成为中华绒螯蟹等淡水养殖品种疾病预防的新途径，从而改变目前这种主要依靠药物的局面，开辟水产养殖病害防治新天地。

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