大黄素通过调控ROS和NLRP3炎症体通路改善草酸钙结晶诱导的肾小管上皮细胞损伤

高丙鹏，田 静，靳银山，刘亚东，于时良，刘健男

(1.毕节市第一人民医院泌尿外科，贵州毕节 551700；2.毕节市七星关区中医院，贵州毕节 551700；3.哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科，黑龙江哈尔滨 150001)

以肾结石和肾钙质沉着症为代表的晶体相关肾损伤是常见的肾脏疾病，通常源于代谢失衡和集合系统解剖结构的异常[1-2]。其中与高草酸尿症相关的草酸钙结石是最常见的结石类型[3]。氧化应激和炎症反应是草酸钙结石肾损伤中的主要病理过程。草酸钙结晶可以激活NLRP3炎症体导致炎症因子成熟并释放，进而引起局部微环境病变乃至肾功能损伤[4]。结石导致的活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成也可通过氧化应激途径促进肾小管上皮细胞脂质过氧化以及组织器官损伤[5]。因此具有抗炎抗氧化的药物被广泛用于防治肾结石形成及肾功能损伤[6]。

大黄素(Emodin)是传统中药大黄的主要成分，是一种蒽醌类衍生物(图1A)，具有抗炎、抗感染、抗氧化、抗纤维化及免疫调节的作用[7-9]。Emodin被证实可以通过NLRP3炎症体途径改善哮喘小鼠的气道炎症反应[10]。但其针对草酸钙结石肾损伤是否存在保护作用尚未得到证实。本研究从体外试验层面探究Emodin是否可以改善草酸钙结晶引起的肾小管上皮细胞的氧化应激与炎症损伤，从而为Emodin等具有抗炎抗氧化作用的药物在肾结石疾病中的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK2)购自于中国科学院细胞库。高糖DMEM合成液体培养基(美国Gibco公司)，草酸(Na2C2O4)、氯化钙(CaCl2·2H2O)、Emodin(美国Sigma公司)，兔抗人NLRP3单克隆抗体、兔抗人IL-18单克隆抗体、兔抗人IL-1β单克隆抗体(中国万类生物公司)，小鼠抗人ASC单克隆抗体、小鼠抗人cleaved-caspase-1单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)，小鼠抗人GAPDH单克隆抗体(中国中杉金桥公司)，CCK-8试剂盒(日本同仁化学研究所)，活性氧检测试剂盒(中国碧云天生物技术有限公司)，IL-18及IL-1β酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒(美国Boster公司)。

1.2 细胞培养将HK2细胞培养于含体积分数为10%的胎牛血清及体积分数为1%的青-链霉素双抗的高糖DMEM培养液中，于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中常规传代培养。对数生长期的细胞按照实验要求分别给予草酸钙结晶及Emodin干预。研究分为3组：对照组、草酸钙干预组、草酸钙+Emodin干预组。实验组细胞用10 μmol/L Emodin预处理2 h后，再用0.5 mmol/L的草酸钙结晶处理24 h[11]。

1.3 草酸钙结晶的制备将10 mmol/L的草酸和10 mmol/L的氯化钙溶解在去离子水中并混合使其浓度为5 mmol/L。使用HCl和NaOH将混合物调节至生理pH值7.4，在室温下沉降24 h后以2 000 g的离心力离心5 min。获得的草酸钙晶体用甲醇洗涤并室温干燥，收集后使用紫外线灭菌以备用[12]。

1.4 免疫印迹(Western blot)实验干预后的细胞提取总蛋白并采用蛋白质定量法测定蛋白浓度，用12.5 g/L的SDS-PAGE凝胶电泳分离后电转至聚偏氟乙烯膜，5 g/L脱脂奶粉室温封闭1 h。然后孵育NLRP3、ASC、cleaved-caspase-1、IL-18及IL-1β抗体并4 ℃冰箱过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h后滴加电化学发光(electrochemiluminescence，ECL)液进行显影。Image Lab软件分析蛋白条带的灰度值后进一步用内参GAPDH标准化并分析目的蛋白的表达差异。

1.5 细胞活力测定细胞活性使用CCK-8试剂盒进行检测。HK2细胞在96孔板内生长至对数期，约7 000个/孔。在0.5 mmol/L草酸钙结晶及相应浓度的Emodin处理24 h后(每组设6个复孔)，每个孔加入10 μL CCK-8溶液并37 ℃孵育1 h。于波长450 nm处用酶标仪检测吸光度并计算细胞活性。

1.6 ROS检测干预后的细胞用无血清培养液洗去残余药物后，在含DCFH-DA探针的无血清培养液中重悬，在37 ℃培养箱中避光孵育20 min，期间每隔3～5 min混匀吹打1次。每组均取相同数目的细胞重悬于500 μL的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中。滤过并转移至流式BD管后，摇匀并上机检测。结果采用流式分析软件FlowJo进行分析。

1.7 培养液IL-18及IL-1β水平的测定各组细胞培养液提取后离心(离心力1 000 g，10 min)。取上清液用ELISA法对炎症因子IL-18、IL-1β浓度进行测定，于波长410 nm处用酶标仪检测吸光度并计算炎症因子浓度。

2 结 果

2.1 Emodin对肾小管上皮细胞损伤的改善CCK-8实验显示草酸钙结晶能明显降低细胞活性(图1B)。Emodin的预处理可以改善草酸钙结晶对细胞的损伤，并在一定范围内呈浓度依赖性。细胞活性实验表明浓度为10 μmol/L的Emodin对肾小管上皮细胞在草酸钙结晶损伤中的保护效果最佳，因此后续实验选择此浓度为干预条件。

2.2 Emodin对氧化应激反应的抑制作用流式细胞仪检测发现(图2)，草酸钙结晶的干预会使肾小管上皮细胞内ROS发生率显著增加。与对照组相比，草酸钙结晶组ROS的生成增加了4～5倍。而与草酸钙结晶单独干预组相比，Emodin的加入显著降低了细胞内ROS水平。

2.3 Emodin对肾小管上皮细胞炎症反应的缓解Western blot显示与对照组相比(图3)，草酸钙结晶干预显著增加了细胞内NLRP3炎症体组成蛋白(NLRP3、ASC、Pro-caspase-1)及下游相关炎症因子(Cleaved-caspase-1、IL-18、IL-1β)的表达。而Emodin预处理可以显著下调该NLRP3炎症体通路相关蛋白(NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Cleaved-caspase-1、IL-18、IL-1β)的表达。

A：Emodin结构式；B：细胞增殖与毒性试验。图1 Emodin结构及细胞增殖与毒性试验图

A：流式细胞术检测各组ROS表达量；B：柱状图定量分析。组间对比，**P<0.01。图2 不同治疗组ROS表达量分析图

A：Western blot检测炎症相关蛋白NLRP3、ASC、Pro-caspase-1、Cleaved-caspase-1、IL-18、IL-1β的表达量；B：蛋白表达量的柱状图定量分析。与对照组比较，##P<0.01;与草酸钙组比较，**P<0.01。图3 Emodin对草酸钙结晶引起的炎症相关蛋白表达水平的影响

2.4 Emodin对细胞分泌炎症因子的影响ELISA检测显示(图4)，草酸钙结晶干预增加细胞培养基中炎症因子IL-18及IL-1β的含量。与对照组相比，草酸钙结晶组的培养液中IL-18/IL-1β浓度升高2～3倍，而Emodin的预处理可以显著缓解该分泌炎症因子的升高，各组间差异显著，P<0.01。

与对照组比较，##P<0.01;与草酸钙组比较，**P<0.01。图4 Emodin对各组细胞分泌炎症因子水平的影响

3 讨 论

解除解剖梗阻以及在饮食上限制草酸的摄入一直以来都是肾结石的主要治疗方案。然而，研究表明慢性肾结石及肾钙质沉着症会造成肾功能严重损伤，由此我们意识到在肾结石中保护肾功能十分重要[13]。肾结石的肾功能损伤主要来源于局部的炎症反应和氧化应激[5]。NLRP3炎症体通路及氧化应激已被证实参与草酸钙结石的病理生理过程[5,14]，因此有必要寻找有效的抗炎抗氧化途径治疗草酸钙结石导致的肾损伤。

ROS作为氧化应激的主要调节因子，已经被证明是结石病理损伤中的主要参与者[15]。相关研究表明ROS水平升高会引起肾小管上皮细胞脂质过氧化，组织的炎症反应以及肾功能损伤[16]。也有研究表明ROS可以通过NF-κB途径促进NLRP3、pro-IL-18/1β等炎症相关蛋白的表达，启动NLRP3炎症体通路并引起炎症反应[17]。我们的研究也表明草酸钙结晶的干预会引起ROS上调，而Emodin预处理可以显著缓解该氧化应激损伤并保护细胞活性。

NLRP3炎症体通路在草酸钙结石肾损伤中的作用已经在体内和体外实验中得到证实：草酸钙结晶可以通过刺激NLRP3炎症体分泌IL-1β导致肾小管上皮细胞炎性损伤[18]；同时NLRP3炎症体通路是高草酸尿症大鼠肾功能衰竭的重要病理途径[5]。我们也在体外实验角度证明了这一点，草酸钙结晶的干预显著上调肾小管上皮细胞NLRP3炎症体相关蛋白的表达及IL-18、IL-1β炎症因子的分泌，同时该炎症反应可被Emodin显著改善。NLRP3炎症体的触发包括启动和激活2个连续但功能独立的步骤，其中炎症体的启动触发炎症体组成蛋白NLRP3、ASC、Pro-caspase-1的合成，炎症体的激活触发NLRP3炎症体的组装与活化及下游炎症因子的激活[19]。研究表明，ROS是参与这2个环节的关键因子[19]。我们的结果亦与之相符，即在草酸钙结晶和Emodin干预模型中，ROS与NLRP3炎症体通路是被同向调节的。然而在草酸钙结晶肾损伤中NLRP3炎症体通路是否由ROS直接调控尚需进一步探索。

Emodin作为传统中药大黄根茎的有效成分，具有广泛的药理作用，被应用于抗癌、保肝、抗菌、抗炎及抗氧化领域[7]。其分子作用机制也从多角度进行了阐述，如：Nrf2/ARE/HO-1信号通路，IRS2/PI3K/Akt通路，NLRP3炎症体通路[20-22]。然而，关于Emodin在草酸钙结晶炎症损伤及氧化应激损伤中的作用尚无研究。本研究通过体外实验首次论证了Emodin在该领域的保护作用及其作用机制，与Emodin在其他领域中的报道一致，我们发现Emodin可以显著改善草酸钙结晶引起的肾小管上皮细胞毒性、ROS生成和炎症因子的表达。该结果证明Emodin可以通过调控ROS及NLRP3炎症体通路改善草酸钙结晶引起的肾小管上皮细胞损伤。然而，Emodin在肾结石体内模型的保护效果及具体作用靶点有待研究。

综上所述，本研究首次从细胞层面验证了Emodin可以通过调控ROS及NLRP3炎症体通路抑制草酸钙结晶引起的肾小管上皮细胞氧化应激和炎症损伤。为草酸钙肾结石的防治、Emodin及类似药物的临床应用提供了新的研究方向与思路。