IL-32表达与食管鳞癌放疗后预后的关系

马志宇，郭加友，董 振，郭嘉漪，程贝贝，马建新

食管癌在中国的发病率居于世界前列[1]。其中食管鳞癌的新发病例数约占世界新发食管癌总数的53%[2]。目前放疗是临床上食管癌综合治疗的关键手段之一，主要包括术前放疗、同步放化疗，但是食管癌病人的5年存活率仅为15%～25%[3]。大量饮酒和吸烟及其协同作用是食管癌的主要危险因素[1]。此外，肿瘤与炎症之间存在一定联系[4]。2005年，KIM等[5]首次正式报道了一种新的促炎症因子-自然杀伤细胞转录物4的基因产物，并命名为白细胞介素(interleukin，IL)-32。近年有研究[6-11]表明，IL-32表达的高低与肿瘤细胞凋亡、转移、侵袭存在一定关系，甚至抑制肿瘤生长，但这种关系在不同的肿瘤中存在差异，并且对预后也产生不同的影响。基于此，本研究通过免疫组织化学法检测95例食管鳞癌病人肿瘤组织，了解IL-32在食管鳞癌组织中的表达情况，探讨病人IL-32与放疗预后关系。现作报道。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2014年1月至2016年1月连云港东方医院及连云港市第二人民医院收治的食管鳞癌病人95例。纳入标准：确诊为食管鳞癌病人，行根治性放射治疗，临床病理信息完整。所有病人均行食管镜活检，经病理诊断确诊为鳞癌，并在放疗前行胸部CT，腹部及锁骨上彩超等基线检查。其中男66例，女29例；年龄39～83岁；肿瘤位置：胸上段19例，胸中段42例，胸下段34例；根据UICC/AJCC第七版食管癌TNM分期标准：Ⅱ期49例，Ⅲ期46例；淋巴结转移阳性36例，阴性59例；中-高分化60例，低分化35例。其中行单纯放射治疗40例，行同步放化疗55例(化疗方案为以铂类为基础的联合化疗或多西他赛单药化疗)。

1.2 放疗方法 所有病人均行6 mV高能X线放射治疗。食管病灶区域放射治疗为60～66 Gy，各段相应淋巴结引流区域放射治疗为50 Gy。单次剂量为2 Gy，每天1次，每周5次。危及器官控制剂量：肺V20≤30%，V30≤20%；心脏V40≤40%；脊髓最大剂量<45 Gy。

1.3 观察指标 采用免疫组织化学法检测病人食管鳞癌组织中IL-32表达。兔抗人IL-32多克隆抗体购自美国Proteintech公司，免疫组织化学染色试剂盒购自武汉Servicebio公司。严格按照试剂说明完成实验。组织切片使用二甲苯、各浓度乙醇梯度脱蜡，使用柠檬酸钠-EDTA抗原修复液修复。3%H2O2孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，BSA血清封闭30 min。加入稀释的兔抗IL-32抗体孵育，4 ℃过夜，选择相应的二抗室温孵育2 h，DAB显色，苏木精复染，脱水、透明、封片，显微镜采集图像并进行数据分析。以细胞质呈现黄色或棕黄色颗粒为IL-32阳性细胞，400倍显微镜下观察并对阳性细胞和所有细胞数进行计数，根据细胞染色程度和阳性细胞相对总细胞百分比，对染色结果进行半定量分析。细胞染色程度：0分为无色或淡蓝色无颗粒，1分为浅黄色颗粒，2分为较多棕黄色颗粒，3分为大量棕黄色或深棕色颗粒。每张切片阳性细胞占总细胞百分比：0分为<5%，1分为5%～<25%，2分为25%～<50%，3分为50%～<75%，4分为≥75%。两项评分乘积<4分计为阴性，其余计为阳性。

1.4 统计学方法 采用χ2检验、Kaplan-Meier生存分析、log-rank检验和Cox比例风险回归模型。

2 结果

2.1 IL-32高表达与低表达病人的相关特征比较 95例中IL-32低表达54例(56.84%)，高表达41例(43.16%)。高表达组与低表达组病人性别、年龄、肿瘤位置、是否合并化疗差异均无统计学意义(P>0.05)，而2组肿瘤分化程度差异有统计学意义(P<0.05)(见图1、表1)。

表1 不同临床病理特征病人的IL-32表达(n)

2.2 IL-32与预后影响因素分析 Kaplan-Meier生存分析显示，IL-32高表达组与IL-32低表达组预后差异有统计学意义(P<0.05)(见图2)。Cox多因素分析显示，合并化疗和IL-32高表达是食管鳞癌放疗病人预后的独立影响因素(P<0.05)(见表2)。

3 讨论

25%的上皮源性肿瘤由慢性感染或者慢性炎症导致[12]。作为一种新的促炎症因子，IL-32基因位于人类染色体16p13.3上。IL-32有9种可变剪接的亚型，分别为IL-32α、IL-32β、IL-32γ、IL-32δ、IL-32ε、IL-32ζ、IL-32η、IL-32θ、IL-32small。就分子量及对细胞作用而言，IL-32γ是最大最有效的亚型[13]。研究[14]表明，IL-32的结构呈现典型的α-螺旋，类似于黏附激酶的黏附靶区(FAT)，而这是整合素结合后的重要信号传导介质。所以因IL-32类似于FAT的结构，其可能成为FAT活化的天然调节因子。

IL-32通过对许多癌症细胞的代谢和调亡产生不同作用而影响肿瘤进展。本研究结果显示，IL-32高表达组与IL-32低表达组预后差异有统计学意义，IL-32高表达是食管鳞癌放疗病人预后的独立影响因素。提示IL-32高表达病人放疗后预后优于IL-32低表达者。而DONNEM等[8]在肾透明细胞癌的研究中发现，IL-32过表达与高复发率呈正相关关系，与无病生存率和总生存率呈负相关关系。不过有研究[15]发现，在人IL-32γ过表达转基因小鼠模型中，IL-32γ会通过抑制持续激活的NF-κB和信号转导和转录激活因子(STAT)3来抑制体外和体内黑素瘤和结肠癌肿瘤生长。STAT3是STAT蛋白家族的主要成员和重要的核转录因子。STAT3目前被认为是增加放射敏感性的关键基因，抑制STAT3/HIF-1α/VEGF信号通路可以逆转食管癌细胞的放射抵抗[16-17]。因此，有理由认为高表达的IL-32可能通过抑制STAT3信号通路增强食管癌放疗效果，继而影响食管癌预后。同时本研究结果也显示，合并化疗是食管鳞癌放疗病人预后的独立影响因素。有研究[18]表明，不同亚型的急性白血病血清中IL-32表达程度不同。化疗与IL-32亦可能发生协同作用，增加化疗效果，延长病人总生存时间。

综上，IL-32高表达是中期食管鳞癌放疗后预后的独立影响因素，IL-32可能作为一种新的治疗靶点，为食管鳞癌的治疗提供新的方法。但本研究属于回顾性研究，且总样本量较少，仍需要开展大样本、多中心的前瞻性研究进一步验证。未来还需进一步阐明IL-32及各种亚型对食管鳞癌细胞放疗作用的分子机制。