厚皮甜瓜种质蔓枯病抗性评价与遗传多样性分析

朱凌丽 徐建 姚协丰 徐锦华 李苹芳 柳李旺 羊杏平

摘要： 采用苗期蔓枯病接种和单核苷酸多态性（SNP）基因型分析对120份厚皮甜瓜高代自交系进行抗性评价与遗传多样性研究。结果显示：光皮类型厚皮甜瓜中高抗、中抗种质资源占比达11.11%，其抗性水平结构优于网纹甜瓜和哈密瓜。统计分析结果显示，21个SNP位点的PIC值为0.050～0.478，其中12个中度多态SNP位点的PIC值平均为0.37，表明甜瓜种质的多态性中等。群体结构与聚类分析结果表明，124份甜瓜种质资源可分成5大类群，各类群具有一定的独立性，且类群间存在明显的差异，遗传多样性丰富。

关键词： 厚皮甜瓜;种质资源;蔓枯病;抗性评价;遗传多样性

中图分类号： S652  文献标识码： A  文章编号： 1000-4440（2021）02-0454-11

Abstract： The gummy stem blight （GSB） resistance evaluation and genetic diversity study of 120 high generation inbred lines of muskmelons were conducted via inoculation at seedling stage and single nucleotide polymorphism （SNP） genotype analysis. The results showed that， the proportion of germplasm resources of smoothbark muskmelons with high and medium resistance to GSB was up to 11.11%， and the structure of resistance level was better than that of netted melon and Hami melon. The statistical analysis results showed that， the polymorphism information content （PIC） value of 21 SNP loci ranged from 0.050 to 0.478， and the average PIC value of 12 moderate polymorphic SNP loci was 0.37， indicating that the polymorphism of the melon germplasms was moderate. Results of population structure and clustering analysis showed that， the 124 melon germplasms could be classified into five major groups， and each group showed certain independence. Furthermore， there were obvious differences between different groups and the genetic diversity was abundant.

Key words： muskmelon;germplasm resources;gummy stem blight;resistance evaluation;genetic diversity

甜瓜是世界范围内重要的经济作物，在热带、亚热带及温带地区广泛种植，具有极高的食用和经济价值。据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，2018年全球甜瓜栽培面积约1.05×106 hm2，其中中国甜瓜栽培面积占总量的34.3%，年总产量1.278×107 t，位居世界之首。厚皮甜瓜是食用栽培甜瓜的一种类型，较薄皮甜瓜品质优良，香甜可口，营养丰富，是广受国内外市场欢迎的高档果品。随着哈密瓜东移栽培的成功，厚皮甜瓜逐渐成为中国主要的设施栽培瓜类作物[1]。但是中国东部地区气候湿润，在保护地栽培的甜瓜极易诱发瓜类蔓枯病，严重时常常造成毁灭性减产[2]。

生产中主要通过使用化学药剂防治蔓枯病，不仅成本高、效率低，还会引发病原菌的抗药性与环境污染等问题[3]。防治实践表明，利用抗源选育抗病品种是防治甜瓜蔓枯病最经济有效的措施[4]。因此，利用致病力强的蔓枯病病菌人工接种厚皮甜瓜种质资源，鉴定其抗性，筛选出抗病或耐病的种质，可以从源头上解决蔓枯病问题，并为选育优质抗病品种奠定基础。近年来国内甜瓜蔓枯病的研究多侧重于对地方品种的抗病性鉴定[5]，以及蔓枯病抗性遗传关系分析及抗性基因定位[6-7]，亟需对厚皮甜瓜种质资源进行蔓枯病抗性评价。而且目前厚皮甜瓜商业品种多为杂交种，育种者为获取其优良特性进行多代自交获得骨干亲本，造成目前厚皮甜瓜种质资源的亲缘关系相近，遗传背景趋于模糊[8]。因此，利用分子标记鉴定技术，完善厚皮甜瓜种质资源遗传多样性评价体系，明确其种质遗传多样性分布特点，对厚皮甜瓜的品种选育与种质创新以及甜瓜产业的发展都具有重要意义。

本研究对江苏省农业科学院蔬菜研究所西甜瓜创新团队多年选育的120份厚皮甜瓜高代自交系材料進行蔓枯病抗性鉴定，分析不同类型及地理来源甜瓜种质资源对蔓枯病的抗感性;同时筛选厚皮甜瓜单核苷酸多态性（SNP）引物，对124份甜瓜种质资源的遗传多样性进行分析，以期为厚皮甜瓜核心种质构建、种质创制、抗病新品种选育等研究工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料准备

供试甜瓜种质资源共124份（表1），包括厚皮甜瓜120份、薄皮甜瓜（抗蔓枯病对照）3份和厚皮哈密瓜雪里红（感蔓枯病对照）1份。其中厚皮甜瓜种质资源为江苏省农业科学院蔬菜研究所从国内不同省份和日本、韩国、东南亚、美国及欧洲等不同国家及地区收集，经多代自交选择获得的高代自交系;薄皮甜瓜引自美国，为抗蔓枯病对照材料;雪里红由新疆农业科学院哈密瓜研究中心培育，为感蔓枯病对照材料。厚皮甜瓜中有网纹甜瓜种质资源48份，哈密瓜种质资源43份，光皮甜瓜种质资源27份。2017年秋季于江苏省农业科学院蔬菜研究所玻璃温室内进行甜瓜育苗，每份材料種植20个单株，日温25～28 ℃，夜温18～20 ℃，长至2～3张真叶时备用。

蔓枯病病菌[Didymella bryoniae （Auersw.） Rehm]选择DBJSJY2作为接种菌株，该菌株由江苏省农业科学院蔬菜研究所瓜类作物研究室从田间收集、分离、鉴定和保存，致病力强，稳定性好。接种前将DBJSJY2接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基上，16 h/d光照、26～28 ℃培养1周。参照姚协丰等[9]方法利用黄瓜培养蔓枯病病菌分生孢子（图1）。用刀片刮取菌块，研磨后以无菌水冲洗，用4层灭菌纱布过滤冲洗液，在显微镜下将分生孢子悬浮液调整为1 ml 5×105个备用。

1.2 取样及DNA提取

对124份甜瓜种质资源叶片用标准打孔器打孔取样，每份资源材料取8张叶片，液氮冷冻保存。采用十六烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠（CTAB/SDS）方法提取组织DNA。DNA溶解后用BioTEK多功能酶标仪测定OD值，包括OD230、OD260、OD280。通过1%琼脂糖凝胶于120 V电泳30 min，确定DNA的完整性。

1.3 蔓枯病病菌苗期接种及病情鉴定

参照周晓慧等[10]方法进行苗期接种，在甜瓜苗期3～4叶期时用喷雾器喷洒孢子悬浮液（按1 ml 5×105个的密度，加1% Tween80），喷至植株叶片开始滴水为止。每份材料处理5株，3次重复，以清水为对照。接种后置于拱棚内覆膜并加盖遮阳网，保证湿度在90%以上，温度控制在25 ℃左右，3 d后揭开拱棚。

甜瓜苗期活体接种后分别在第7 d、11 d、15 d调查统计蔓枯病病害发生情况。参照Gabriele等[11]方法，根据植株不同部位发病情况及病斑大小进行抗性分级统计：0级，无症状;1级，叶片发黄（仅疑似感病）;2级，叶片有轻微症状（<20% 坏死）;3级，叶片有中度症状（21%～45% 坏死）;4级，叶片有严重症状（>45% 坏死）;5级，有叶片病死，茎上无症状;6级，叶片有轻微症状（<20% 坏死），叶柄和茎上也有坏死（<3 mm）;7级，叶片有中度症状（21%～45% 坏死），叶柄和茎上也有坏死（3～5 mm）;8级，叶片有严重症状（>45% 坏死），叶柄和茎秆坏死（>5 mm）;9级，植株死亡。平均病情级别数（RI）计算公式：RI=∑（各级值×株数）/总株数。根据平均病情级别数确定蔓枯病抗性级别。高抗（HR）： RI≤2.0;抗（R）： 2.06.0。

1.4 SNP引物设计合成

以检出率100%、杂合率<30%、最小等位基因频率（MAF）>40%、上下游100 bp内没有其他SNP、基因组单拷贝为标准，挑选了40个均匀覆盖甜瓜基因组的SNP标记[12-15]。根据SNP位点设计PCR 3′末端扩增引物，设计软件为Primer5，引物Tm值为55～65 ℃。每个SNP位点设计2条SNP特异性引物和1条通用引物，引物由Lifetech公司合成。

1.5 SNP基因分型验证

竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele specific PCR，KASP）反应体系：10 ng基因组DNA， 5.00 μl KASP V4.0 2×Master Mix， 0.14 μl KASP 72×assay mix， 加ddH2O至10.00 μl（适用96孔板）。其中KASP V4.0 2 ×Master Mix购于LGC公司，包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B、高保真Taq酶、dNTP等。KASP 72×assay mix由浓度为100 μmol/L的SNP1-A1、SNP1-A2、SNP1-C1与ddH2O按照12∶12∶30∶46（体积比）混合组成。试验同时设置不加模板的空白对照，每个PCR板中设置1个空白对照。梯度PCR反应程序如下：95 ℃ 15 min，10个循环;94 ℃ 20 s，61 ℃（每个循环降0.6 ℃） 退火60 s，26个循环;94 ℃ 20 s，55 ℃退火60 s。采用双向单激发读板仪PHERAstar 对PCR扩增产物进行扫描，羧基荧光素（FAM）激发波长为485 nm，发射波长为520 nm，六氨-6-甲基荧光素（HEX）激发波长为528 nm，发射波长为560 nm，系统参比荧光（ROX）激发波长为575 nm，发射波长为610 nm。

采用KrakenTM软件对双向单激发读板仪PHERAstar进行扫描数据分析：聚合在接近X轴、显示蓝色的样本基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因，聚合在接近Y轴、显示红色的样本基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因，中间显示绿色的样本基因型为上述2种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能是DNA质量或浓度问题而使扩增产物没有明确分型，显示黑色的样本为空白对照[16]。

1.6 统计分析

病情级别统计数据利用DPS统计软件进行相关性分析。SNP位点基因型频率数据使用PIC-CALC软件计算分析多态信息量（PIC值）。利用Structure 2.3软件计算遗传相似系数，用Structure 2.3软件分析群体结构及其遗传多样性，选择最佳群体组群数（K），并在计算时将K取值范围设置为1～8，重复8次，采用Admixture model，计算△K值作为衡量最佳K值的标准。获得聚类矩阵，利用Structure软件进行数学模型聚类分析，基于结构程序生成聚类图。

2 结果与分析

2.1 不同厚皮甜瓜种质资源对蔓枯病病菌的抗病性

利用喷雾接种法鉴定120份厚皮甜瓜种质资源对蔓枯病病菌的抗性反应。除1份材料（编号102）出苗情况不佳未能接种外，其余119份自交系材料和感病对照（雪里红）在接种3～5 d后均开始发病。具体症状表现为：子叶最先出现失绿斑点，随着病斑的扩展而坏死;叶部出现褪绿色病斑，并逐渐扩大扩展为“V”形病斑;茎秆晚于子叶、叶片发病，感病时出现水渍状病斑，逐渐扩大后渗出少量红色胶状物（图2）。不同材料的發病程度不同，蔓枯病抗性对照PI140471达到高抗水平。在119份自交系中未发现免疫或高抗材料，除PI 200819、PI 482398两份抗病对照达到抗（R）级别外，发现8份厚皮甜瓜自交系抗蔓枯病，其平均病情级别数在2.00至3.00之间。此外还有30份自交系平均病情级别数小于4.00，对蔓枯病表现为中抗（MR），其余材料均易感蔓枯病（表2）。

群体中筛选到抗性种质资源8份，占比6.7%，包括4份网纹甜瓜种质资源、3份光皮甜瓜种质资源以及1份哈密瓜种质资源。这8份抗性种质资源在果实形状、果皮果肉颜色和果肉质地方面表现迥异，可作为优质种质资源加以利用（表3）。其中M-16-TH-39、M-17-108为光白皮圆果，全生育期110 d，中心糖分含量别为16.0%、14.5%，是开展早熟、高品质、抗病厚皮甜瓜育种的优良种质; M-17-58-8-7的果肉中心糖分含量达到17.4%，绿色果肉风味浓厚，是较为难得的高糖优质抗病种质资源。

2.2 119份厚皮甜瓜种质资源地理来源与蔓枯病抗性关系分析

将119份厚皮甜瓜种质资源按照地理来源划分成6组，其中来源于国内的种质资源按地理来源划分成2个组，即中国南方组和中国北方组。国外有日本和韩国组、东南亚组、欧洲组、美国组。统计分析结果表明，不同地理来源的甜瓜自交系中都有抗性材料分布，但是不同地理来源抗性材料占比差别较大，东南亚组内达到中抗（MR）级别以上的材料占比最高，达到66.70%（图3）。中国南方组中达到抗（R）与中抗级别的材料数量最多，抗级别的材料占比最高，达到11.36%。达到抗病级别的种质资源都来源于中国、日本和韩国。

2.3 SNP位点筛选及PIC值分析

从ARAYA荧光阅读仪上读取荧光信号，然后将结果导入数据库，采用KrakenTM软件对双向单激发读板仪PHERAstar扫描获得的数据进行分析，124个甜瓜种质资源中含有候选SNP位点的3个基因型类别。通过KrakenTM软件从40个均匀覆盖甜瓜基因组的标记中筛选出21对多态性较好的SNP引物（表4）。

根据21个SNP位点的基因分型，分析21个SNP在所测试甜瓜种质资源中的基因型频率和多态信息量，结果显示，21个SNP位点的PIC值为0.050～0.478（表5）。

2.4 甜瓜种质资源群体结构及遗传多样性分析

用Structure 2.3软件计算△K值，作为衡量最佳K值的标准。结果显示，当K=5时△K最大（图4）。依据K=5时分析获得的数据，在Simulation Result 中用bar plot 绘制各个材料在各群中所占比例（图5）。由图5可以看出，124份甜瓜种质资源分成5大类群（5种颜色表示5个类群），各群体间存在明显的差异，并具有一定的独立性，这说明供试的甜瓜种质资源存在明显的群体结构。抗蔓枯病材料主要集中在绿色的第2大类和粉色的第5大类中。第2大类全部为软肉类型甜瓜种质资源，蓝色的第3大类以脆肉型甜瓜为主，黄色的第4大类全部为来源于新疆和上海的哈密瓜，第5大类以网纹甜瓜为主。

根据材料的地理来源，用Structure软件分析得到124个甜瓜种质资源聚类三角图（图6），3个角顶点代表3个群组。Cluster 1群组主要为来源于中国新疆、上海和欧洲的厚皮甜瓜种质资源，Cluster 2群组主要为来源于日本、韩国、中国台湾及美国的厚皮甜瓜种质资源，其中黄色点为引自美国的薄皮甜瓜种质资源，在Cluster 1和Cluster 2中间聚类，表现出一定差异性。All others 群组主要包括来源于甘肃、河南的种质资源。棕色点为来源于江苏的种质资源，在3个组群都有分布，说明来源于江苏的部分种质资源与3个类群间的差异都比较大，在中间聚类。同一地理来源的厚皮甜瓜种质资源可能聚在同一类群组，也可能交叉分布在不同群组，可见其聚类并不完全以地理来源为标准。

图6中的绿色点代表引自中国新疆的厚皮甜瓜材料，淡蓝色点代表引自中国上海的厚皮甜瓜材料，粉红色点代表引自欧洲的厚皮甜瓜材料，棕色点代表引自中国江苏的厚皮甜瓜材料，深紫色点代表引自日本的厚皮甜瓜材料，淡紫色点代表引自中国台湾地区的厚皮甜瓜材料，卡其色点代表引自美国的厚皮甜瓜材料，黄色点代表引自美国的薄皮甜瓜材料，深蓝色点代表引自中国甘肃的厚皮甜瓜材料。

3 讨论

3.1 厚皮甜瓜种质对蔓枯病的抗病性评价

高温、高湿有利于甜瓜蔓枯病的发生，在相同的利于发病的栽培环境中，来源于内陆干旱地区的甜瓜种质资源更容易感病，来源于沿海等潮湿地区的厚皮甜瓜因自然压力的选择积累遗传，通常能够适应潮湿的气候环境，会对蔓枯病形成不同程度的抗敏反应。张学军等 [17]对国内外190份甜瓜种质进行蔓枯病苗期筛选时，发现来源于中国新疆的甜瓜资源全部表现为高感。本试验所用哈密瓜种质资源中抗性材料占比明显低于网纹甜瓜和光皮甜瓜，来源于中国新疆的哈密瓜材料全部感病，达到抗、中抗级别的3份哈密瓜材料则分别来源于中国上海、中国江苏和中国台湾。参试的光皮甜瓜种质资源主要来源于日本和中国江苏，其抗性材料占比较高，达到高抗、抗级别的材料占比达到11.11%。欧洲栽培厚皮甜瓜的历史悠久，并拥有包括罗马甜瓜、网纹甜瓜、冬甜瓜等在内的多类型、数量丰富的甜瓜种质资源。而本试验所用的欧洲甜瓜种质资源仅16份，占材料总数的13.4%，筛选出抗蔓枯病材料1份。通过对厚皮甜瓜种质进行蔓枯病抗性评价，筛选出了能应用于抗性改良。同时具有优良性状的种质，对于从源头上解决蔓枯病问题具有广泛的应用价值。

3.2 厚皮甜瓜种质遗传多样性

多态性位点效率往往可以揭示不同种质材料间的遗传多样性。本研究从40个SNP位点中筛选出21个SNP位点设计引物组合，对124份甜瓜种质进行了分析，发现有12个位点的PIC值处于中度多态，PIC值平均为0.37，表明这些位点在甜瓜种质间多态性程度中等。同时，使用Structure软件对供试甜瓜种质材料进行了基于数学模型的类群划分，所划分的5个群体材料各具遗传特征。本方法主要基于模型，具有不过分依赖于遗传距离、避免人为因素干扰等优点，可以在不了解材料背景时，结合样品的遗传信息和额外的地理来源信息、表型性状等对群体综合分类，相比于遗传距离可以更加真实地反映材料间在遗传上的差异[18]。本研究划分的5类群体，除了作为对照的薄皮甜瓜外，其他群体均为栽培种自交系，表明基因间有一定渗透性。这可能是有些最初来源相同的材料各自在不同生态环境栽培过程中，在分子水平上积累的遗传变异所导致。

本试验材料包括中国江苏、中国上海、中国新疆、中国河南、中国台湾、日本、美国、欧洲等15个不同地理来源的种质资源。Structure聚类分析能够把部分种质资源的地理来源区分开来，如将甘肃材料、日韩（中国台湾）材料、新疆和上海材料区分为3个组别，这些同一地理来源材料倾向于聚在一起，可能与同一地理来源材料间相对亲缘关系比较近有关。日本、韩国、中国台湾地区作为传统的优质厚皮甜瓜种质来源地，材料亲缘关系也比较近，主要与其材料类型一致性较高有关，同时也表明不同地理来源甜瓜种质资源存在丰富的遗传多样性。通过对厚皮甜瓜种质资源进行遗传多样性分析，掌握高代自交系的遗传多样性和类群间的遗传关系，能够使育种思路更加清晰，育种目标更易实现，同时也为厚皮甜瓜核心种质构建、种质创制等工作提供了理论依据。

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（责任编辑：张震林）