不同麻醉方式对自发性高血压大鼠脑出血凋亡基因表达水平的影响

赵广平， 陈永学， 甄书青， 侯俊德， 刘 飞

(河北省邯郸市中心医院麻醉科， 河北 邯郸 056001)

高血压脑出血是高血压人群常见疾病之一，其发病率和致残率均较高，我国发病率约为17.1%～55.4%，现已成为我国第一大致残因素和第三大致死疾病[1]。研究表明，脑出血后血肿周围脑组织存在着逐渐加重的脑水肿和脑组织缺血半暗带损伤区，及时有效的手术干预对于减少病死率和提高患者的生活质量具有积极意义[2]。随着手术方式的不断改进，近年来以神经内镜技术为主的微创手术开始受到广泛关注，全麻下行开颅显微手术取得良好疗效。靶控静脉麻醉是一种通过调节作用药物浓度控制麻醉深度的麻醉方式，能有效减少患者应激反应，减轻血流动力学影响[3]，但有关麻醉方式对脑出血病灶区脑组织神经细胞的研究仍鲜有报道。本研究旨在通过构建自发性高血压大鼠脑出血模型，在动物模型上探究不同麻醉方式对脑出血大鼠神经细胞凋亡情况的影响，明确不同麻醉方式对脑出血病灶的直接影响，从而为指导临床提供可靠参考。

1 资料与方法

1.1一般资料

1.1.1实验动物:30只健康自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rat，SHR)，雌雄各半，体重 250～300g，均于SPF级动物房中进行适应性饲养，室温22～24 ℃，相对湿度50～60%，通风良好，环境安静，期间自由饮水，自由摄食。实验动物购于广东省医学实验动物中心。所有动物实验均经伦理委员会批准。

1.1.2主要试剂:Ⅶ型胶原酶(美国Sigma公司)；Trizol裂解液、BCA蛋白定量试剂盒(美国Invitrogen公司)；实时荧光定量逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒均(日本TaKaRa公司)；兔抗鼠β-actin单克隆抗体、鼠抗人Bcl-2体抗单克隆抗体、鼠抗人Bax体抗单克隆抗体、鼠抗人Caspase-3体抗单克隆抗体(美国Abcam公司)；Tunel试剂盒(美国Roche公司)；PBS磷酸盐缓冲液、蛋白上样缓冲液(中国上海碧云天生物工程研究所)。

1.2方 法

1.2.1动物分组与模型构建:所有动物适应性饲养一周后，术前12h禁食，4h禁水。所有实验大鼠均采用大鼠自体血注入法建立脑出血模型[4]：大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，根据图谱定位大鼠右侧尾壳核，于此处采用牙科制备直径约1.5mm的圆孔，至硬脑膜表面。采用微量注射器抽取股动脉新鲜动脉血液50μL，经钻孔垂直注入脑。分次退针，医用骨蜡封闭，观察无血液溢出后，缝合、包扎。模型构建成功后，将实验大鼠随机分成两组，每组15只，分别麻醉A组和麻醉B组。采用3%戊巴比妥(65mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠生效后，给予气管插管后机械通气。麻醉A组大鼠术中分次经尾静脉推注芬太尼+2.5%七氟烷维持麻醉；麻醉B组大鼠术后给予1.5ng/mL舒芬太尼+2.5μg/mL丙泊酚靶控静脉持续输注维持麻醉。分别于造模术后6h、12h、24h、48h、72h，每组随机取3只大鼠处死取脑，去除低位脑干、前方嗅球和后方小脑，4%多聚甲醛固定待用。

1.2.2神经行为学评分:各组大鼠分别于术后6h、12h、24h、48h、72h进行Bederson's神经行为学评分[5]：以行为均正常记0分；以提鼠尾离地约1尺，手术对侧前肢内旋、内收记1分；以推大鼠双肩，手术对侧抗力下降记2分；观察大鼠在水平面行走情况，以围绕健侧转圈记3分；以不能自主活动记4分。分数越高说明神经损伤越严重。

1.2.3脑组织含水量检测:实验动物取脑后，去除小脑及脑干，称量湿重，将样本置于80℃恒温箱中干燥，48h后称量样本干重，根据公式：脑组织含水量(%)=(脑组织湿重-脑组织干重)/脑组织湿重×100%。

1.2.4TUNEL染色法检测脑组织神经细胞凋亡:实验动物脑组织4%多聚甲醛固定过夜后予以双蒸水冲洗、脱水、脱酒精、氯仿透明后浸蜡、石蜡包埋后制成蜡块，制备厚度为2～3μm切片，使用In Situ Cell Death Detection Kit进行TUNEL染色，滴加TUNEL反应液50 μL(Enzyme solution及Label Solution按1∶9配制，即用即配，冰上操作)，保湿、避光、37℃孵育60min；PBS漂洗后，滴加DAPI至完全覆盖细胞以复染核；再次漂洗后，滴加抗荧光淬灭剂于载玻片上，将爬片倒扣在滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上封片，于400×显微镜下观察染色效果。

1.2.5免疫组化实验检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3表达情况:取保存于多聚甲醛中的脑组织，采用脱水机进行自动脱水处理，随后采用包埋机进行石蜡包埋处理，冰冻后制备连续切片，每片厚度约为2.0μm。将切片置于二甲苯及梯度酒精中依次浸泡脱蜡、脱水，使用PBS洗涤3次，于切片上滴加枸橼酸钠缓冲溶液。滴加10%山羊血清进行封闭处理，干燥后，滴加Bax、Bcl-2及Caspase-3单克隆抗体4℃孵育过夜。37℃孵育二抗1h，PBS洗涤3次，采用DAB化学发光剂显影。自来水冲洗后，苏木素复染30s。冲洗后将切片至于梯度酒精进行脱水处理。随后置于梯度二甲苯溶液中进行透明处理。随后使用中性树脂覆盖玻片进行封固。于光学显微镜下观察并采集图片，应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件处理并作统计，观察不同组别样本中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡标志蛋白表达情况。

1.2.6RT-PCR实验检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平:脑组织细胞总RNA采用Trizol法，用紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，A260/280在1.8～2.0。按照mRNA反转录试剂盒操作说明进行反转录，参照SYBR®Premix Ex Taq TM试剂盒说明进行RT-PCR检测，反应程序：95℃ 2min，95℃ 15s，60℃ 30s，68℃ 60s，40个循环，最后95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s收集荧光信号，计算相对定量结果。所有试验重复3次，相对定量分析按照2-[△△Ct(实验组)-△△CT(对照组)]求出Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA表达水平。Bax、Bcl-2、Caspase-3引物及内参GAPDH印物均由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成。

1.2.7Western Blot实验检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3 表达水平:大鼠脑组织每例约50mg，加入组织蛋白提取液，置于冰盒中，充分碾磨，10000r/min离心10min取上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒对提取的蛋白进行定量，根据标准曲线计算蛋白含量。各组以30～60μg相同的蛋白上样量，煮沸变性后进行10% SDS-PAGE凝胶电泳。电泳完成后，使用半干转仪转移至PVDF膜，然后用5%脱脂牛奶封闭1h，使用抗Bax抗体(1∶1000)、抗Bcl-2抗体(1∶1000)、抗Caspase-3(1∶800)4℃孵育过夜。PBS-Tween20液漂洗，HRP标记的二抗反应，再次用PBS-Tween20液洗膜，ECL显色，凝胶成像仪中曝光和拍照，检测脑组织中Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡标志蛋白表达情况。灰度值用Image Pro Plus 6.0软件来测定。每组实验重复3次。

1.3统计学处理:应用SPSS20.0统计软件进行分析。采用Shapro-Wilk检验数据是否符合正态分布，采用Bartlett检验进行方差齐性检验。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组数据间均数比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同麻醉大鼠术后神经行为学评分比较:两组大鼠术后不同时点神经行为评分均明显增高，与麻醉A组比较，麻醉B组大鼠在术后6h、12h、24h、48h、72h等同时点时神经行为评分明显较低(P<0.05)，组间差异具有统计学意义。见表1、图1。

图1 不同麻醉大鼠术后神经行为学评分比较

表1 不同麻醉大鼠术后神经行为学评分比较

2.2不同麻醉大鼠术后脑组织含水量比较:两组大鼠术后出现不同程度脑水肿，麻醉B组大鼠在术后6h、12h、24h、48h、72h时与同时点麻醉A组比较，脑组织含水量均明显较低(P<0.05)，组间差异具有统计学意义。见表2、图2。

表2 不同麻醉大鼠术后脑组织含水量比较

图2 不同麻醉大鼠术后脑组织含水量比较

2.3不同麻醉大鼠脑组织细胞凋亡数比较:两组大鼠术后脑组织样本均可见TUNEL阳性表达细胞，阳性表达主要集中于神经元胞核，呈点状或团状深棕色颗粒。两组大鼠术后6h、12h、24h、48h、72h时细胞凋亡数均呈现增加趋势，且麻醉A组大鼠术后6h、12h、24h、48h、72h时细胞凋亡数均明显高于同时点麻醉B组大鼠(P<0.05)，组间差异具有统计学意义。见图3。

图3 不同麻醉大鼠脑组织细胞凋亡数比较(×40)

2.4不同麻醉大鼠脑组织凋亡相关蛋白阳性表达情况比较:免疫组化实验结果显示，不同麻醉方式干预后，随着时间点的延长，Bax、Bcl-2及Caspase-3等凋亡相关蛋白表达水平均明显升高，与麻醉A组比较，同时点麻醉B组在脑出血术后6h、12h、24h、48h、72h各时点Bax及Caspase-3蛋白表达水平均明显较低(P<0.05)，且麻醉B组在术后6h、12h、24h、48h、72h各时点Bcl-2蛋白表达水平则明显高于同时点麻醉A组(P<0.05)，组间差异具有统计学意义。见图4。

图4 不同麻醉大鼠脑组织凋亡相关蛋白阳性表达情况比较(×40)

2.5不同麻醉大鼠脑组织凋亡相关蛋白mRNA表达情况比较:麻醉干预后即刻，麻醉A组大鼠脑组织中Bax及Caspase-3等促凋亡蛋白mRNA表达水平明显高于麻醉B组(P<0.05)，麻醉A组大鼠脑组织中凋亡抑制蛋白Bcl-2 mRNA表达水平则明显低于麻醉B组水平(P<0.05)，组间差异具有统计学意义。见图5。

2.6不同麻醉大鼠脑组织凋亡相关蛋白表达情况比较:麻醉干预后与麻醉B组比较，麻醉A组大鼠脑组织中Bax及Caspase-3等促凋亡蛋白表达水平明显较高(P<0.05)，其脑组织样本中凋亡抑制蛋白Bcl-2表达水平则明显低于麻醉B组水平(P<0.05)，组间差异具有统计学意义。见图6。

3 讨 论

静脉吸入复合麻醉是指患者同时或先后实施静脉全身麻醉和静脉吸入麻醉的一种麻醉方式，具有麻醉起效快、术中易控制、麻醉维持稳定等优点，但在术后应激反应、认知功能障碍、术后不良反应方面具有一定的局限性[6,7]。靶控静脉麻醉是一种通过调节目标药物浓度控制麻醉深度的麻醉方式，具有麻醉深度易于控制、术后认知功能影响小、术后不良反应少、患者应激反应小等明显优势[8,9]。既往脑出血相关麻醉方式及药物研究主要在大体标本水平进行疗效评估，在分子及基因水平方面研究鲜有报道。由此本研究提出科学问题：不同麻醉方式对脑出血病灶区细胞凋亡情况是否具有影响。

自发性高血压大鼠是目前国内公认的最接近人类高血压的动物模型[10]。本研究选取自发性高血压大鼠作为动物模型，为控制脑出血病灶的部位和出血量大小，采用脑组织内直接注入自体血的方法构建脑出血动物模型。该方法是最常用的脑出血动物模型构建法，形成的血肿形态大小较稳定，同时还可模拟血液成份对自身脑组织的损伤作用，适用于研究脑出血后脑水肿改变及机体神经功能改变情况。根据麻醉方式不同，实验大鼠分为采用静脉吸入复合麻醉的麻醉A组和采用丙泊酚复合舒芬太尼靶控静脉麻醉的麻醉B组。实验结果显示，脑出血模型大鼠在麻醉后6h即开始出现不同程度神经行为学改变及脑水肿改变，且随着时间点的延长，模型大鼠神经行为学评分明显增加，脑组织含水量也明显增加，与麻醉A组比较，麻醉B组大鼠在术后不同时点神经行为学评分及缺血区脑组织含水量均明显较低(P<0.05)，提示靶控静脉麻醉能在一定程度上减少脑出血大鼠脑组织含水量，并减轻神经行为学评分。进一步的细胞凋亡能力实验结果显示，与麻醉A组大鼠比较，麻醉B组在各时点凋亡细胞数均明显较低(P<0.05)，麻醉B组大鼠脑出血病灶区脑组织神经细胞中凋亡相关蛋白Bax及Caspase-3表达水平均明显低于同时点麻醉A中组(P<0.05)，凋亡抑制蛋白Bcl-2水平则明显高于同时点麻醉A中组(P<0.05)，说明靶控静脉麻醉可减少脑出血后神经细胞中凋亡相关蛋白表达，从而减少神经细胞凋亡，猜测与舒芬太尼半衰期短、血脑屏障分散快、清除率高等因素有关，提示在麻醉过程中始终处于动态管理状态的靶控静脉麻醉能更好的为实验动物提供补偿，降低神经细胞凋亡及损伤。

综上所述，丙泊酚复合舒芬太尼靶控静脉麻醉有效控制麻醉深度及药物作用浓度，减少脑组织神经细胞凋亡相关蛋白表达，减轻脑出血及脑组织水肿程度，改善神经行为学评分，对于保障手术患者的神经功能具有积极意义。