激动髓样细胞-2触发受体减轻围术期神经认知障碍*

2021-06-30田芳芳呼芳芳赵静王宁马磊

西部医学 2021年6期

田芳芳呼芳芳赵静王宁马磊

(1.西安交通大学第二附属医院麻醉科，陕西西安 710004；2.空军军医大学第二附属医院，陕西西安 710038)

围术期神经认知障碍(Perioperative neurocognitive disorders，PND)是指与术前相比,术后短期及长期学习、记忆和神经心理学测试等执行功能下降的一种临床综合征[1-2]。当前众多研究表明PND是重大手术后的重要并发症[3-4]，其与不良结局密切相关[5-7]。但是，PND的发病机制仍然不明。有证据表明，外科创伤引起的炎症在PND的发生中起关键作用[8-9],且炎症因子的高低与血浆和海马组织中细胞因子水平的升高相平行，阻断炎症能够减少记忆障碍[10-14]。髓样细胞2-触发受体(Triggering receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2)是TREM家族的免疫球蛋白样受体，目前相关研究认为细胞高表达TREM2在免疫监视、细胞间相互作用和抑制潜在的炎症反应中起重要作用[15-17]。相反，当细胞中缺乏TREM2则会增加促炎性细胞因子产生[18]。因此，TREM2被认为是神经炎症的重要负性调节剂。但是，当前还缺少TREM2在外科手术中参与调节神经炎症和认知功能的研究。本研究探讨在骨科手术后，小鼠海马中TREM2和促炎因子的表达情况，并探究改变TREM2表达是否可以改变小鼠的神经炎症以及学习和记忆障碍。

1 实验和方法

1.1 实验动物动物实验已获得西安交通大学(中国西安)动物实验伦理委员会的批准，并按照其动物实验指南进行。雄性野生型C57BL/6小鼠购自西安交通大学实验动物中心。在药物干预或手术之前，将小鼠(4个月大)适应性饲养至少一周，光照/黑暗周期为12小时，温度为21±2℃，湿度为60%～70%。

1.2 研究方法

1.2.1 实验方案实验第一部分：验证模型的成功及术后激动髓样细胞-2 (TREM2)的表达，将20只雄性野生型C57BL/6小鼠随机分为对照组和手术组两组，每组各10只，对照组小鼠仅给予异氟烷麻醉，麻醉时间与手术组小鼠相同；手术组小鼠在异氟烷麻醉下接受胫骨骨折髓内固定术。在手术前24小时对小鼠进行恐惧条件训练，恐惧条件测试(Fear conditioning test,FCT)分别在术后1、3和7天进行,并采用旷场实验评估小鼠的运动能力。在最后一次行为评估后，将动物处死进行western blot检测TREM2的表达。(为排除异氟烷的干扰，本研究对对照组和手术组均进行了异氟烷麻醉处理，麻醉时间相同)。实验第二部分：将40只小鼠随机分为对照组、手术组、HSP60+手术组和TREM2-siRNA+HSP60+手术组4组，每组各10只。对照组小鼠仅给予异氟烷麻醉，麻醉时间与手术组小鼠相同；手术组小鼠在异氟烷麻醉下接受胫骨骨折髓内固定术。手术前30分钟将TREM2-siRNA立体定向注射入侧脑室，方法按照我们先前实验，可使用亚甲蓝检测注射效率[19]。将选择性TREM2受体激动剂热休克蛋白60(HSP60)在麻醉苏醒后立即腹腔注射(5μg/小鼠)，按前述方法每24小时注射一次，连续7天，在手术前24小时对小鼠进行恐惧条件训练。FCT分别在术后1、3和7天进行,并采用旷场实验评估小鼠的运动能力。在最后一次行为评估后，一半小鼠(n=5)用于Western blot和ELISA分析，另一半(n=5)用于免疫荧光检测，见图1。

图1 实验流程图Figure 1 Experimental protocol

1.2.2 手术模型采用文献报道方法[20],小鼠在异氟烷麻醉下接受了胫骨骨折髓内固定术，在膝盖以下切开皮肤，暴露胫骨，将0.3毫米针头插入髓腔以实施髓内固定，然后于中点断裂胫骨，消毒并缝合切口。手术持续约10分钟，总麻醉时间约20分钟。在手术过程中，使用加热垫将小鼠的直肠温度维持在(37±0.5)℃。麻醉后，将小鼠于加热毯保持体温直至完全苏醒，返回饲养笼。为了减轻皮肤切口的疼痛，在切口处局部使用2%利多卡因溶液浸润麻醉，并且于手术后在伤口中每天两次施用1%盐酸丁卡因凝胶3天。

1.2.3 旷场实验在恐惧条件训练和测试前15分钟进行了旷场测试。于昏暗灯光下，将每只小鼠轻轻放在旷场的中心，让其自由移动5分钟。通过自动分析系统自动记录运动过程。通过总的探索距离来测量小鼠的运动能力。在每次测试后，用75%的乙醇洗涤测试场地，以避免出现嗅觉提示。

1.2.4 条件性恐惧测试采用文献报道方法[20]，进行条件性恐惧测试过程，包括术前训练以及术后1、3和7天的测试。简而言之，在手术前一天，对小鼠进行条件性恐惧训练以建立长期记忆。在测试阶段，仅将小鼠放在测试室中5分钟，不要用脚踩电击。记录潜伏期百分比(定义为小鼠不活动但呼吸的时间)。

1.2.5 小干扰RNA转染对C57BL/6小鼠体内进行了小干扰RNA(siRNA)体内转染。简而言之，立体定位坐标为前囟部后0.4 mm，中线外侧1.0 mm，颅骨表面下方2.5 mm，将不锈钢套筒植入侧脑室。根据制造商说明书，在手术前30分钟，分别将2μL TREM2-siRNA的稀释混合物立体定位注射到侧脑室。

1.2.6 蛋白印迹分析(Western Blotting) 处理后收集小鼠的海马组织蛋白，并如先前所述进行蛋白质印迹分析[22]。使用了抗TREM2兔抗体(1∶200)和辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔二抗(1∶10000)。通过化学发光技术检测抗原。图像分析通过Image J软件进行。

1.2.7 实时定量PCR 使用RNeasy试剂盒(美国QIAGEN)从冷冻海马组织中提取RNA，而高容量cDNA逆转录试剂盒(美国Life Technologies)用于反转录。使用ABI Prizm 7500热循环仪，使用TaqMan引物(美国Life Technologies)和TaqMan Universal PCR Master Mix(美国Life Technologies)进行实时PCR，以GAPDH为参照，用2ΔΔCt法比较TREM2基因的表达水平[23]。

1.2.8 酶联免疫吸附测定根据ELISA试剂盒方案，将海马样品在PBS中制备组织匀浆，离心(10,000 rpm，5分钟)，收集上清液用于ELISA检测。使用96孔板在450nm处测量吸光度，并测量白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)，白介素-6(Interleukin-6，IL-6)，肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)的表达。

2 结果

2.1 手术诱发小鼠PND的发生，并降低海马中TREM2的表达首先，我们探讨了异氟烷麻醉下的手术是否可以诱发PND的发生以及术后海马组织中TREM2的表达变化。分别在手术后1、3和7天FCT前15分钟评估手术对运动能力的影响，通过在旷场内5分钟内的总移动距离以评估运动能力。各组小鼠基线运动能力差异无统计学意义，表示小鼠的运动能力不受手术影响，见图2A～D。进行FCT的情境测试，以评估海马依赖性记忆。与对照组相比，手术组小鼠术后1、3和7天的冻结时间均减少(P<0.05)，见图2E-G。Western blot结果显示：手术组小鼠海马区TREM2表达下降，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见图2H-I。

图2 手术对小鼠运动能力及学习记忆能力的影响Figure 2 The effect of surgery on the movement,learning and memory ability in mice注：A-D.旷场实验小鼠运动总距离；E-G.条件性恐惧测试中术后1、3和7天冻结时间百分比统计图；H-I.Western blot检测海马中TREM2的表达及统计结果(①P<0.05 表示与对照组相比差异有统计学意义，n=10)

2.2 选择性TREM2受体激动剂HSP60降低了手术后PND的发生率，但是侧脑室内注射TREM2-siRNA消除了HSP60对小鼠的作用分别在手术后1、3和7天FCT前15分钟，评估手术和药物治疗对运动能力的影响。各组小鼠基线运动能力差异无统计学意义，表示运动能力不受手术和药物治疗的影响，见图3A-D。进行FCT的情境测试以评估海马依赖性记忆。与对照组相比，手术后1、3和7天小鼠冻结时间均显著减少(P<0.05)，见图3E-G。与手术组相比，HSP60治疗组在手术后三个时间点冻结时间明显增加(P<0.05)，使用TREM2-siRNA可以显着消除HSP60诱导的效应(P<0.05)。

图3 上调TREM2对小鼠运动能力以及依赖性记忆的影响Figure 3 The effect of TREM2 up-regulation on the movement and dependent memory of mice注：A-D.旷场实验小鼠运动总距离；E-G.条件性恐惧测试中术后1、3和7天凝固时间百分比统计图(①P<0.05为对照组vs手术组差异有统计学意义，②P<0.05为手术组vsHSP60+手术组差异有统计学意义，③P<0.05为HSP60+手术组vsTREM2-siRNA+HSP60+手术组差异有统计学意义n=10)

2.3 HSP60增加手术后海马组织中TREM2的表达，而侧脑室内注射TREM2-siRNA可逆转HSP60对小鼠的影响手术诱导海马组织TREM2表达降低。HSP60治疗减轻了手术引起的TREM2下调，而TREM2-siRNA逆转了HSP60的作用。Western blot与实时定量PCR分析结果显示，与对照组相比，术后7天手术组小鼠海马组织中TREM2表达显着降低(P<0.05)。与手术组相比，HSP60治疗在术后7天导致TREM2表达增加(P<0.05)，而给予TREM2-siRNA逆转了上述HSP60的作用(P<0.05)，见图4。

图4 HSP60对小鼠海马组织中TREM2表达的影响Figure 4 The effect of HSP60 on TREM2 expression in mouse hippocampus注：A-B.Western blot检测海马中TREM2的表达及统计结果；C.实时定量PCR分析TREM2的表达(①P<0.05为对照组vs手术组差异有统计学意义，②P<0.05为手术组vs HSP60+手术组差异有统计学意义，③P<0.05为HSP60+手术组vs TREM2-siRNA+HSP60+手术组，差异有统计学意义，n=5)

2.4 HSP60减少手术后促炎因子释放并增加抗炎和神经营养因子释放，且脑室内注射TREM2-siRNA可以消除HSP60对小鼠的影响与对照组相比，手术后7天手术组小鼠海马组织中TNF-α，IL-1β和IL-6水平明显升高(P<0.05)，HSP60处理降低了TNF-α，IL-1β和IL-6的水平(P<0.05)，给予TREM2-siRNA可以逆转HSP60效应(P<0.05)。以上结果表明，HSP60诱导的TREM2表达增加可以降低手术后脑组织的炎症反应，见图5。

图5 上调TREM2对小鼠脑炎性因子的影响Figure 5 The effects of TREM2 up-regulation on inflammatory factors in mice注：A-C.ELISA检测海马中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达及统计结果(①P<0.05为对照组vs手术组差异有统计学意义，②P<0.05为手术组vs HSP60+手术组差异有统计学意义，③P<0.05为HSP60+手术组vs TREM2-siRNA+HSP60+手术组差异有统计学意义，n=5)

3 讨论

本实验的目的是探究异氟烷麻醉下接受胫骨骨折髓内固定术的成年小鼠的围术期神经认知障碍、神经炎症和TREM2表达之间的关系。据我们所知，这是第一次探索TREM2对接受外科手术小鼠学习和记忆的影响。此外，本实验探究了TREM2激动剂HSP60对其上调和TREM2-siRNA对其下调对手术小鼠学习和记忆的影响，并评估了与记忆功能密切相关的小鼠海马组织中的炎症反应。结果表明，手术后小鼠海马依赖性记忆受损，术后HSP60干预减轻了手术引起的记忆障碍，减少了促炎因子的释放，而TREM2-siRNA逆转了上述HSP60诱导的有益作用。

研究表明，异氟烷麻醉下手术可能会引起神经炎症，在小鼠中诱发PND，并损害海马依赖性学习和记忆功能。本研究通过条件性恐惧测试检测海马功能[20-21]。神经炎症与认知障碍有关，是PND的主要发病机制[21]。此外促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，已被广泛研究为与认知障碍相关的神经炎症介质[21-22]。在本研究中，观察到手术后海马组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，从而导致记忆障碍，这与文献报道结果是一致的，表明神经炎症和术后认知障碍同时发生。此外毫无疑问，异氟烷对小鼠认知功能障碍具有一定的影响[23]，因此在本研究中，为最大的降低麻醉药物带来的负面效应，我们对对照组和手术组均进行了异氟烷的麻醉，以尽可能的保证实验结果的可靠性。

TREM家族受体仅在髓样细胞上被检测到，并认为与先天免疫反应有关[24]。TREM2基因位于小鼠染色体17C上[25]，在大脑中，TREM2在小胶质细胞中高度表达，最近发现是阿尔茨海默症的危险基因[26-28]。TREM2还通过调节炎性因子的释放来调节周围组织的炎性过程[29]。TREM2缺乏在实验性自身免疫性脑脊髓炎模型中引起不受控制的炎症[18]。因此，TREM2在神经炎症的负调控中起关键作用[30]。在本研究中，我们还发现手术并没有损害小鼠的运动能力，各组小鼠间的总运动距离间差异无统计学意义。另外，手术后TREM2表达降低，但通过使用选择性TREM2激动剂HSP60后，小鼠海马组织中TREM2的表达显着增加，从而改善了学习和记忆功能，减轻了小鼠的神经炎症。但是，TREM2-siRNA消除了HSP60诱导的TREM2表达的增加，并逆转了HSP60诱导的对学习和记忆功能的改善以及对大脑炎症的减轻作用。因此，TREM2的上调可能与减轻神经炎症以及改善学习和记忆功能有关，并最终减少PND的发生。

本研究仍然存在一些局限性。首先，我们的研究强调了小鼠海马组织中由手术引起的神经炎症，但没有评估全身性炎症。其次，在这项研究中，我们仅使用siRNA下调TREM2表达，在未来的工作中我们将使用基因敲除小鼠来验证我们的发现。