高通量测序与染色体核型分析技术用于产前诊断的比较分析

朱晓丹，李 超，欧妙玲，张玲华，黄 湘

（佛山市妇幼保健院产前诊断中心 广东 佛山 528000）

我国每年出生的新生儿中约有100万人患有不同程度的先天缺陷，约占每年新生儿出生总数的5%～6%。先天性缺陷一方面会降低人口素质，另一方面还会增加患儿家庭的负担，消耗大量的社会资源。针对这种情况为了进一步提高我国人口素质，降低新生儿出生缺陷率，就有必要对妊娠期孕妇进行产前诊断，明确胎儿可能存在的遗传性疾病或先天性缺陷。目前，在相关临床诊断中比较常用的是染色体核型分析技术，但是该技术具有较为明显的缺陷。近些年来针对传统染色体核型分析技术以及高通量测序技术的快速发展，临床上开始采用高通量测序技术进行产前诊断，与传统染色体核型分析技术相比，该技术操作相对简单方便，且能够在较短的时间内得出检测结果，具有较高的检测效率[1-2]。

1.资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2020年1月—10月收治的631例高危孕妇，年龄21～43岁，平均年龄（31.29±2.45）岁；孕周最长16～37周，平均（28.23±2.85）周；高龄孕妇156例，无创基因检测（NIPT）提示高风险71例，胎儿超声异常186例，血清学筛查高风险175例，不良孕产史43例。部分孕妇存在多种产前诊断指征。

1.2 方法

（1）采集样本。孕周低于28周的孕妇在超声引导下行羊膜腔穿刺术采集30 mL羊水，整个过程严格遵循无菌原则以及相关要求；采用脐静脉穿刺术采集孕周达到28周及以上的孕妇的脐带血2 mL。（2）染色体核型分析。染色体核型分析共使用20 mL羊水或1 mL脐血，采用培养瓶传代法培养羊水样本9～12 d，采用外周血淋巴细胞培养基培养脐血样本68～72 h。之后收获、制片、G显带，使用Leica-120进行采集图像，计数细胞数20个，分析细胞数5个。以《人类细胞遗传学国际命名体制》ISCN2016中的相关规定为依据描述核型。（3）高通量测序分析。高通量测序检测共使用10 mL羊水或1 mL脐血，使用美国illumina公司生产的高通量测序仪（型号：NextSeq 500）对羊水及脐血进行检测，整个检测过程严格按照说明书及相关规定进行。

2.结果

2.1 染色体核型检测结果

染色体核型检测共发现62例胎儿染色体异常，占比9.81%。50例为染色体数目异常，此外还发现7例9号染色体臂间倒位及10例异染色质区长度改变，见表1。

表1 631例高危产妇染色体核型检测结果

2.2 高通量测序检测结果

高通量测序检测共发现96例胎儿含有缺失、重复片段，占比15.21%。小于5 Mb片段共38段，6例良性片段；32例非良性片段（32/631，5.07%），见表2。

表2 631例高危产妇高通量测序检测结果

2.3 染色体核型检测与高通量测序检测结果比较

对于染色体数目异常胎儿，染色体核型检测与高通量测序检测结果相符合。对于染色体结果异常胎儿，高通量测序检测未发现平衡易位、倒位及正常多态性中的9号臂间倒位及异染色质区增长。与染色体核型分析相比，高通量测序额外测出32例小于5 Mb片段非良性片段，见表3。

表3 染色体核型检测与高通量测序检测结果比较

3.讨论

在本文中染色体核型检测共发现2例胎儿染色体异常，占比2.5%，且2例胎儿均为染色体数目异常；高通量测序检测共发现2例胎儿染色体异常，占比2.5%。1例为45, X（1/80，1.25%），另1例为47, XX，+18（1/80，1.25%）。两种检查方法相比，结果一致，但高通量测量未发现7例9号染色体臂间倒位与10例染色体异染色质区长度改变的胎儿。一般认为，染色体多态性现象属于正常变异，历年ISCN对多态性种类均有描述，包括及异染色质区长度改变。染色体多态性中临床最为常见的臂间倒位类型就是inv（9）（p12q13），倒位区域包含9号异染色质区[3]。9号染色体臂间倒位携带者，一般不会有相应的临床症状表现出来。有研究显示该倒位不会影响生育。不过，大部分相关方面的专家学者认为生殖失败与inv（9）有关。有增加其他染色体异常的趋势且可能影响胚胎种植，影响精子的质量及功能。其原因在于，即使inv（9）在人群中有较高的携带率，但从种类进行分类，属于结构改变。随着检测技术的更新和对非编码基因研究的深入，越来越多的学者认识到inv（9）很可能在细胞分裂中形成配对环，造成同源染色体配对困难，使染色体分离发生异常，从而形成异常的配子和合子，导致胚胎发生染色体非整倍体变异或减数分裂中异常配子的产生，最终引起流产、不孕不育、死胎及其他症状的临床效应[4-5]。

高通量测序技术与传统染色体核型分析技术相比，两者对被检测物质的特异性与敏感性较为一致，并且能够对染色体发生的微小变异进行精准测量与分析，操作者的个人主观意念对其影响较小，与此同时结果具有良好的重复性。与传统染色体核型分析技术相比，高通量测序技术的优势主要在于能够在较短的时间内得到检测结果，理论上只需要3 d左右的时间，时间优势明显[6]。另外，由于检测前不需要培养羊水，因此可以避免在培养羊水的过程中因意外事件导致整个检测失败。在平衡易位/倒位时，如果细胞内核算数量保持正常，并没有出现异常变化，那么对于实际上存在的异常现象，常规测序技术往往无法进行有效监测。虽然临床上可以通过提高测序深度的方法更加准确、有效的检测平衡易位/倒位，但是其存在成本过高、技术难度较大、对样本DNA的质量要求高等问题，因此很难在临床上推广应用该方法。

综上所述，在产前诊断过程中高通量测序技术与染色体核型分析技术均能够有效检测出染色体异常的胎儿，但高通量测序技术无法检测出9号染色体臂间倒立与异染色质增加的多态性现象及平衡易位、倒位。高通量测序技术与传统染色体核型分析技术相比，其优势主要在于能检测出5 Mb以下的微缺失微重复，且能够在较短的时间内得到检测结果，不用培养羊水细胞，可以在很大程度上提高检测的成功率。现阶段，临床上可以通过联合使用高通量测序技术与染色体核型分析技术使胎儿出生缺陷检测率得到进一步提高，从而最大程度的发挥出临床检测的实际应用价值。