二氢槲皮素对添加甘油解猪油肉饼抗氧化

李杨，唐志国，刘丽美，马丽媛，刘东琦

绥化学院食品与制药工程学院（绥化 152061）

甘油解猪油是以猪油和甘油为原料在无水环境下进行甘油解反应得到，是甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯和游离脂肪酸的混合物，其中甘油二酯含量相对较高[1]。近些年研究表明甘油二酯拥有营养价值高、人体食用后安全、易于加工等特点，还拥有抑制体重增加、降血脂、减少内脏脂肪积累等功效，是适合人类食用的保健性油脂[2-3]，然而猪油甘油二酯的氧化稳定性相对较弱[4]，限制了其在肉制品中的应用。

二氢槲皮素是一类重要的二氢黄酮类化合物，广泛存在于落叶松中[5]。由于二氢槲皮素为多羟基化合物，特别是5—OH、7—OH及3’、4’临位二羟基的存在，使其具有较强的抗氧化能力[6]。同时，二氢槲皮素还具有抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抑菌等作用，还可以改善心脑血管疾病[7-9]。二氢槲皮素是迄今为止发现的最强效纯天然抗氧化剂[10]。二氢槲皮素有较好的水溶性，极易溶于热水，在冷水中也比大多数黄酮类物质更易溶解，但其在油相中的溶解性较差，限制了其在油脂体系的应用和发展。

本研究将二氢槲皮素通过反相微乳法包裹进甘油解猪油中，并将其应用于肉糜体系，不仅可以提高二氢槲皮素的稳定性和生物利用度，而且可以获得具有甘油解猪油和二氢槲皮素双重功能特性的肉制品，同时解决含甘油解猪油的肉糜制品在贮藏期间出现的氧化问题，该研究为功能性肉制品的生产提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜猪背最长肌（绥化市大润发超市）；猪背脂肪（黑龙江北大荒肉业有限公司）；二氢槲皮素（西安拓丰生物有限公司）；2, 4-二硝基苯肼（DNPH）、5, 5’二硫代二硝基苯甲酸盐（DNTB）（美国Sigma公司）；硫代巴比妥酸TBA（上海山浦化工有限公司）；盐酸胍（上海源叶生物科技有限公司）；其余试剂均为国产分析纯。

JJ-2B型组织捣碎机（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；UT-1800型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；FW12型绞肉机（广东韶关食品机械厂）；XK96-B型漩涡振荡器（江苏新康医疗器械有限公司）；GL-21M型高速冷冻离心机（湖南湘仪实验仪器开发有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 甘油解猪油的制备

参照Diao等[4]的方法采用酶法甘油解制备甘油解猪油，使用高效液相色谱分析甘油二酯含量。

1.2.2 微乳液的制备

将1.2.1得到的甘油解猪油与吐温-80以质量比1∶1混匀后，再与丙三醇以质量比为6∶4的比例于烧杯内再次混合均匀，逐滴加入一定浓度的二氢槲皮素溶液，用磁力搅拌器进行搅拌同时温度调至60 ℃，当体系变浑浊时即得富含二氢槲皮素的甘油解猪油微乳液。

1.2.3 肉饼的制作

将新鲜猪里脊肉去除筋膜和多余脂肪，切成小块、用绞肉机绞碎成泥，随机分成4组（每组900 g）进行如下处理：T1组为900 g肉+100 g脂肪；T2组为900 g肉+92 g甘油解猪油+25 g微乳液；T3组为900 g肉+84 g甘油解猪油+50 g微乳液；T4为900 g肉+100 g甘油解猪油。每个处理组的瘦肉与脂肪质量比为均9∶1，T2组和T3组中二氢槲皮素含量分别为0.1和0.2 g/kg，每组中均加入2%的食盐，斩拌混合均匀后，取50 g肉糜，制成直径约8 cm，厚度约1 cm的肉饼，参照Jia等[11]的方法，将肉饼放入保鲜盒中，用保鲜膜封好，置于4 ℃冰箱贮藏8 d，每隔2 d取样放入匀浆机中粉碎3次，每次10 s，测定各指标。

1.2.4 肌原纤维蛋白的提取

参照Xia等[12]的方法从不同处理组的肉糜中提取，以牛血清蛋白为标准品，利用双缩脲法测定蛋白浓度。

1.2.5 过氧化值（peroxide value，POV）的测定

根据GB/T 5009.37—2003中滴定法测过氧化值的方法，分别称取处理组绞碎的肉饼各2 g，加入30 mL氯仿和冰乙酸（体积比为2∶3）溶解样品，加入1 mL饱和碘化钾溶液摇匀后置于暗处3 min，取出加入100 mL蒸馏水，用0.002 moL/L Na2S2O3标准溶液滴定，至淡黄色时，加入1 mL淀粉指示剂摇匀后继续滴定至蓝色消失，记录消耗Na2S2O3的体积，不加肉样按相同方法作空白试验，结果以meq/kg肉样表示。

1.2.6 共轭二烯烃含量的测定

参考Lee等[13]的试验稍加改动，称量绞碎后的肉样0.5 g，加入5 mL蒸馏水匀浆，然后取匀浆液0.5 mL与5 mL提取液（正己烷：异丙醇，体积比3∶1），振荡1 min混匀后离心（2 000g，5 min），取上清液在233 nm处测吸光度，使用25 000（mol·cm）-1作为摩尔吸光系数，结果用μmol/mg肉样表示。

1.2.7 硫代巴比妥酸值（TBARS）的测定

根据Tarladgis等[14]的方法进行，取绞碎肉样2.5 g，加入17.5 mL 7.5%三氯乙酸（含0.1%乙二胺四乙酸）在高速匀浆机中匀浆后离心（3 000g，2 min）。取5 mL上清液和5 mL 0.02 mol/L的硫代巴比妥酸（TBA）溶液混匀后水浴煮沸40 min，冷却至室温，532 nm处测吸光度，TBARS值以每kg肉样中所含丙二醛的毫克数表示。

1.2.8 酸价的测定

称取绞碎肉样3 g，加入50 mL乙醚-乙醇（体积比2∶1）混合液，漩涡振荡，滴入酚酞指示剂2～3滴，用0.05 mol/L KOH溶液滴定，至出现微红色，且0.5 min内不褪色，即达到滴定终点。结果以每g肉样消耗KOH的毫克数表示。

1.2.9 羰基含量的测定

参照Oliver等[15]的方法稍有改动。将蛋白质浓度调整为5 mg/mL，取1 mL蛋白溶液加入1 mL二硝基苯肼溶液（10 mmol/L），室温静置1 h，期间每15 min漩涡振荡1次，随后加入20%的三氯乙酸（1 mL），8 500g离心10 min，沉淀用1 mL乙酸乙酯-乙醇（体积比1∶1）混合试剂洗3次，除去没有参加反应的试剂，再加入3 mL盐酸胍溶液（6 mol/L），37 ℃保温15 min，充分溶解沉淀后8 500g再离心3 min，除去不溶的物质，370 nm处测上清液吸光度。对照组在开始时加入1 mL不含二硝基苯肼的HCl（2 mol/L），其余操作与上述步骤相同。羰基含量使用分子吸光系数22 000 L·mol/cm来计算，结果表示为nmol羰基/mg蛋白。

1.2.10 巯基含量的测定

参考Ellman[16]的方法略加改动，使用5, 5’-二硫代二硝基苯甲酸盐（DTNB）进行测定。将蛋白质浓度调整为5 mg/mL，取1 mL蛋白溶液加入8 mL Tris-甘氨酸缓冲液（pH 8.0）混合均匀。取4.5 mL混合液加入0.5 mL含10 mmol/L DTNB的Ellman试剂，混匀后室温避光反应30 min，随后冷冻离心15 min（10 000g，4 ℃），上清液于412 nm下测定吸光度，以未加入DNTB为对照。巯基含量使用分子吸光系数13 600（mol·cm）-1来计算，结果表示为nmol巯基/mg蛋白。

1.3 数据统计分析

每个试验重复三次，结果均用平均数±SD表示。差异显著性（p＜0.05）分析采用Statistix 8.1软件进行，作图采用Sigmaplot 12.5软件。

2 结果与分析

2.1 二氢槲皮素微乳液对过氧化值的影响

过氧化值（POV）可以反映氢过氧化物含量，代表脂质初级氧化的程度[17]。图1看出，各处理组肉饼的过氧化值随着贮藏时间的延长均呈现先增加后降低的趋势，贮藏第6天，只添加甘油解猪油的猪肉饼（T4组）POV值显著高于其他处理组（p＜0.05），这可能是由于甘油解猪油中含有的甘油二酯，其氧化稳定性较低[4]，而添加了二氢槲皮素甘油解猪油微乳液的猪肉饼（T2组和T3组）POV值相对较低，且T3组的POV值低于T2组，这是因为T3组中虽然含有较高的甘油解猪油，但二氢槲皮素含量也高，刘妍等[10]报道，二氢槲皮素可有效抑制油脂的氧化。贮藏第6天后，所有处理组的POV值均下降，说明经过诱导期后，氢过氧化物的降解速率高于其生成速率[18]。Georgantelis等[19]报道富含迭迭香提取物的猪肉肠在贮藏过程中，POV值也出现类似的现象。

图1 二氢槲皮素微乳液对冷藏猪肉饼POV的影响

2.2 二氢槲皮素微乳液对共扼二烯含量的影响

肉开始氧化时，不饱和脂肪酸双键会发生位移，形成共轭体系，可以用分光光度法测定[17]。图2看出，添加了二氢槲皮素甘油解猪油微乳液的猪肉饼在贮藏期间，共轭二烯烃的浓度显著低于添加甘油解猪油和猪脂肪的肉饼（p＜0.05），说明二氢槲皮素有效抑制了脂质氧化。共轭二烯烃的形成与氢过氧化物有关，也是发生在脂质氧化的初期阶段，随着贮藏时间的延长，脂质氧化中间产物开始降解而引起含量降低，共轭二烯烃的形成在贮藏第4天时，所有处理组均达到最高值，随后迅速降低。Pena-Ramos等[20]在乳清和大豆分离蛋白水解物对熟肉糜脂质氧化抑制的研究中也发现，贮藏前期共轭二烯烃浓度迅速升高，随后降低。

图2 二氢槲皮素微乳液对冷藏猪肉饼共轭二烯烃的影响

2.3 二氢槲皮素微乳液对TBARS值的影响

脂质氧化产物丙二醛（MDA）能与硫代巴比妥酸反应生成有色化合物，进而可以衡量脂质二次氧化程度。图3所示，在贮藏过程中，各处理组的TBARS值均呈现整体上升趋势，贮藏到第8天，各处理组的TBARS值急剧升高，这可能是由于随着脂肪氧化程度的加深，初期氧化产物进一步分解生成醛、酮等次级氧化产物所致。添加了二氢槲皮素甘油解微乳液的处理组（T2和T3）在整个贮藏过程中显著低于添加甘油解猪油的T4组，这可能是因为二氢槲皮素结构的特殊性，决定了其具有较强的抗氧化性[21]。

图3 二氢槲皮素微乳液对冷藏猪肉饼TBARS值的影响

2.4 二氢槲皮素微乳液对酸价的影响

油脂贮藏过程中，在微生物、酶和热的作用下会发生水解，产生游离脂肪酸，氧化程度越高，酸价越高，产品酸败越严重，因此酸价也是用来评价油脂氧化变质程度的一个重要指标。图4所示，随着贮藏时间的延长，酸价呈现逐渐上升的趋势，添加甘油解猪油和猪脂肪的肉饼（T4和T1）酸价显著高于添加二氢槲皮素甘油解猪油的肉饼（T2和T3）（p＜0.05），说明二氢槲皮素能显著抑制脂质的氧化，且含量越高，效果越好，但T4组和T1组差异并不显著（p＞0.05）。周生学等[22]对长白落叶松3种黄酮化合物的抗氧化活性进行研究，结果发现二氢槲皮素表现出较强的抗氧化活性。

图4 二氢槲皮素微乳液对冷藏猪肉饼酸价的影响

2.5 二氢槲皮素微乳液对羰基含量的影响

蛋白质氨基酸残基受到自由基攻击，会被氧化，进而生成羰基化合物，因此羰基含量可以作为蛋白质氧化的一个重要指标[23]。图5看出，随着贮藏时间的延长，各处理组的羰基含量均呈现出不断增加的趋势，且添加甘油解猪油和猪脂肪的肉饼（T4和T1）显著高于添加二氢槲皮素甘油解猪油的肉饼（T2和T3）（p＜0.05），说明T4和T1组氨基酸的侧链更易被活性氧攻击，生成较多的NH3和羰基衍生物[24]，而添加二氢槲皮素甘油解猪油的T2和T3组被氧化程度较低，且添加较多二氢槲皮素的T3组蛋白被氧化程度最低。这可能是由于二氢槲皮素具有清除自由基的能力。

图5 二氢槲皮素微乳液对冷藏猪肉饼羰基含量的影响

2.6 二氢槲皮素微乳液对巯基含量的影响

蛋白质氧化的另一个重要指标是巯基含量，蛋白分子被自由基攻击后，空间构象发生变化，内部的巯基暴露，被氧化生成二硫键，巯基含量下降的越多，说明蛋白质氧化的程度越高[25]。图6看出，各处理组巯基含量随着贮藏时间的延长，均呈现逐渐降低的趋势，添加二氢槲皮素甘油解猪油的肉饼（T2和T3）下降的幅度相对添加甘油解猪油和猪脂肪的肉饼（T4和T1）比较缓慢，说明二氢槲皮素的分子结构能够抑制自由基的产生[26]。有研究表明[25]，脂肪氧化生成的氢过氧化物和醛类等物质会诱发蛋白质的氧化，反过来蛋白质氧化释放的金属离子又会加速脂肪的氧化。因此本研究得出二氢槲皮素能够抑制蛋白氧化与抑制脂肪的氧化结果相一致。

图6 二氢槲皮素微乳液对冷藏猪肉饼巯基含量的影响

3 结论

随着贮藏时间的延长，添加甘油解猪油和猪脂肪的肉饼脂肪和蛋白质的氧化程度不断加深，表现为TBARS值、酸价和羰基含量不断上升，巯基含量不断下降，POV值和共轭二烯烃先上升后下降；而添加富含二氢槲皮素甘油解猪油后能显著抑制脂肪和蛋白的氧化，有效减缓氧化进程，因此甘油解猪油能很好地保护二氢槲皮素的抗氧化活性，使其均匀地分布于肉制品中，赋予肉制品双重功效。然而关于二氢槲皮素微乳液对肉饼品质的影响有待进一步研究。