油菜苗期抗旱性鉴定及抗旱指标评价

黄 倩，赵永国，徐劲松，曾 柳，吕 艳，程 勇，张学昆，陆光远

(1.广东石油化工学院，广东 茂名 525000; 2.中国农业科学院油料作物研究所，湖北 武汉 430062;3. 浙江大学作物科学研究所/农业农村部光谱检测重点实验室，浙江 杭州 310058;4. 长江大学/湿地生态与农业利用教育部工程研究中心, 湖北 荆州 434023)

油菜是我国最重要的冬季油料作物，菜籽油占国产植物食用油的50%[1]。我国油菜年均种植面积700万hm2左右，其中80%分布在长江流域[2]。随着全球气候变暖，季节性干旱频繁发生，严重威胁到油菜的生产安全。春季干旱正处于油菜生殖生长的关键时期，可显著降低油菜产量，严重时甚至绝产[3]。秋季干旱对油菜种子萌发和苗期产生严重影响，比如，2010年我国发生的秋季干旱持续时间长达70～112 d，黄淮流域和长江中游偏北地区约86.7万hm2油菜受到严重影响，受灾地区油菜单产下降15.5%以上，总产减产达25%～32%[4-5]。因此，开展油菜抗旱育种研究、减少干旱胁迫对油菜生产的危害、保证油菜稳产高产是当前油菜产业需要解决的重要问题。开展抗旱材料的评价、筛选及鉴定则是油菜抗旱育种的前提条件。

作物的抗旱性受多种基因控制，是一个复杂的数量性状，很难直接评估。通常多采用抗旱系数、抗旱指数等指标评估品种抗旱性，这些评价指标已经在油菜、棉花、高粱等作物抗旱研究中得到成功运用[6-8]。朱宗河等[9]利用主成分分析、隶属函数分析以及聚类分析对甘蓝型油菜的抗旱性进行了鉴定和评价。谢小玉等[10]运用聚类分析和灰色关联度分析发现叶片相对含水量、丙二醛、叶面积可作为油菜抗旱种质筛选的依据。陈娇[11]等通过关联度分析发现光合参数指标、含水量指标、植株形态和根系性状指标与油菜苗期的抗旱性关系密切。左凯峰等[12]发现可溶性蛋白、可溶性糖、丙二醛和离体叶片保水力等性状可作为甘蓝型油菜抗旱性苗期鉴定的指标。上述研究通常采用多个生理指标在室内综合鉴定油菜抗旱性，然而其抗旱性鉴定结果的有效性需要其他试验进一步证实，迄今鲜见将室内综合抗旱指标与苗期干旱存活率进行对比的研究，以验证利用综合指标鉴定品种抗旱性的准确性。本研究在前人研究的基础上，利用PEG 6000模拟苗期干旱胁迫，通过对79份油菜材料12个指标的抗旱性的综合评价，分析比较了综合指标与苗期干旱存活率的关系，验证抗旱指标的准确性，同时对各抗旱生理生化指标进行评价，确定了油菜抗旱性鉴定的合适指标，筛选获得一批抗旱材料，为油菜抗旱育种提供理论和材料基础。

1 材料与方法

1.1 材料

使用的油菜材料共79份，其中包括来源于欧洲及日本的44个冬性和14个春性甘蓝型油菜品种，以及来自中国的5个半冬性甘蓝型油菜品种。此外，为了扩大筛选范围，试验材料还包括4份羽衣甘蓝、6份瑞典甘蓝，以及6份饲料油菜(表1)。

表1 本试验用到的油菜材料

1.2 试验设计与处理

每个品种选择大小一致、颗粒饱满的种子先浸泡于浓度为3%的 NaClO溶液中消毒10 min，然后用蒸馏水冲洗净种子，将其移至浸湿1/4浓度的Hoagland[13]营养液的纱布上发芽。待发芽7 d后，挑选长势一致的苗子用方形海绵包裹，移栽到打有孔(孔径d=2 cm)的塑料板中，并将塑料板移至装有8 L营养液(1/2浓度的Hoagland营养液)的深色盒子(34 cm×26 cm×13 cm)内。在恒温生长间内培养，控制光周期时间为16 h/8 h(光照/黑暗)，昼夜温度25℃/18℃，光照强度为300 μmol·m-2·s-1，相对湿度60%～70%。待油菜长至2～3片真叶时转移到含有全浓度营养液(对照CK)和含有2.5% PEG 6000 (m/v)的营养液中(处理组S)培养3 d，然后将处理组PEG 6000浓度提高到5% (m/v) 继续培养3 d。该试验采用随机区组设计，每个处理设置4次重复。

1.3 生理指标的测定

在干旱胁迫处理期间，每天中午13∶00利用手持红外测温仪(Testo 845，德国)定时测定同一叶片

的叶面温度变化，同时每隔1 d利用手持式叶绿素仪(Konica Minolta SPAD-502，日本)测定该叶片的SPAD值。处理6 d后测定叶面积[14]、叶片相对含水量、地上和地下部鲜重，随后于105℃杀青30 min，80℃烘干至恒重后称取干重。同时取叶片用液氮速冻后保存于-80℃；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和游离脯氨酸(Pro)含量均使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，具体方法参考产品说明书进行。叶片相对含水量公式如下[15]：

相对含水量(%)=(W0-W1)/(W2-W1)×100

式中，W0为叶片鲜重，W1为叶片干重，W2为叶片饱和重量(在黑暗的条件下，叶片浸泡在双蒸水中24 h后称重)。

1.4 油菜苗期干旱存活率试验

参考景蕊莲的方法[16]，试验材料种于35 cm×20 cm×10 cm的蓝色塑料盒中。盒中装有过筛后的大田耕土，土层厚8 cm，每个材料20株，每盒8个品种，且每盒都有一个相同的对照品种，试验重复3次。当幼苗长至3叶期时停止浇水，开始自然干旱。每天定时利用快速土壤水分测定仪(TZS-1W型，浙江拓普顿仪器有限公司)测定每盒土壤含水量，当土壤含水量降至5%左右时，进行复水，3 d后观察幼苗存活情况，以芯叶转绿为标准计算每份材料的干旱存活率。

1.5 指标计算

参考陈娇等[11]方法计算抗旱系数DRC(drought resistance coefficient)、隶属函数、抗旱性度量数。计算公式如下：

各指标抗旱系数:DRC=S/C

隶属函数：

抗旱性度量数：

式中，S为干旱条件下各指标的测定值；C为对照条件下各指标的测定值；P为各品种各性状的抗旱系数；Pmin和Pmax为各测定性状抗旱系数的最小值和最大值；Xij为第i品种的第j性状；n为性状数；m为品种数。

1.6 数据统计分析

利用Microsoft Excel对数据进行初步整理，采用DPS 14.5软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫下油菜苗期各性状的变化

表2是79份甘蓝型油菜苗期性状的表型分析结果。由表1可以看出，油菜各性状在正常和干旱条件下均呈现显著的差异。与正常供水(CK)相比，干旱胁迫条件下各项测定指标均呈现明显变化。其中，地上鲜重下降最大，降幅平均达到69.5%；叶面积也显著下降，平均降低了57.9%。这表明在干旱胁迫下植株严重缺水，影响植株正常生长；严重干旱时叶片甚至边缘蜷缩、干枯，植株鲜重显著下降。此外，相较正常水分条件下，干旱胁迫下地上干重、地下鲜重、地下干重均显著下降，降幅分别为33.3%、23.9%和25%(表2)。相较于地上部重量，地下重量降低的幅度较小。这可能是由于油菜在遭受干旱胁迫时，为了抵御干旱胁迫，减少细胞间的渗透压，加速根的生长进而促进水分的吸收。各品种在干旱胁迫条件下抗氧化保护酶活性和脯氨酸含量都显著升高，且脯氨酸含量相较于对照呈几十倍的增加。干旱胁迫后CAT含量平均增加了7.6%，POD含量平均增加了67.2%，SOD含量平均增加了1.2%，脯氨酸含量平均增加了294%。我们还分析比较了上述10个指标在79份油菜资源中的分布规律及遗传差异，结果表明大多性状的抗旱系数总体频次变异表现为近似正态分布(图1)。

表2 PEG6000模拟干旱胁迫对油菜苗期性状的影响

2.2 油菜苗期抗旱性鉴定指标的筛选

将正常和干旱条件下油菜苗期各性状进行了相关性分析，结果见表3。表中对角线的数据是各性状在正常和干旱条件下两者之间的相关性，所有性状在不同水分条件下的测定值均具有较高的相关性。其中，在干旱和正常水分条件下SOD、CAT和POD的相关系数分别为0.626、0.626和0.641，达到极显著水平。地上干重、地下鲜重以及叶面积的相关性也达到极显著水平，相关系数分别为0.838、0.830和0.674，表明在正常条件下表现较好的材料在胁迫条件下也很可能表现较好。另外，在正常水分条件下各指标之间也具有一定的相关性。比如，POD和CAT极显著正相关，相关系数为0.633**，脯氨酸和SOD的相关系数为0.314**；在干旱胁迫下这些相关性仍然达到显著水平(表3)。叶面积与相对含水量在正常水分条件下显著正相关(r=0.249*)，但在干旱胁迫下相关不显著。同时，分析发现地上鲜重、地上干重、地下鲜重和地下干重之间无论是在正常条件还是干旱胁迫下均显著正相关，表明这些指标之间包含有重叠信息，可以精简指标或者通过统计处理后形成新的指标来进行抗旱性鉴定评价。

表3 正常水分和干旱条件下油菜苗期各指标的相关性分析

对各指标的抗旱系数做进一步的相关性分析(表4)，可以看出，叶面积与相对含水量、地上鲜重、地上干重、地下干重和地下干重的抗旱系数均呈显著正相关，相关系数分别为0.238*、0.513**、0.554**、0.540**和0.525**。相对含水量与地上鲜重和地上干重的抗旱系数均显著正相关，相关系数分别为0.47**和0.372**。另外，地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重4个性状的抗旱系数之间呈现显著正相关，因为这些性状本身就具有较高的相关性。然而，抗氧化保护酶(SOD、CAT和POD)的抗旱系数之间的相关性较低；尽管脯氨酸含量与POD抗旱系数的相关性达到显著水平，但相关系数仍然较小(0.258)。

为了进一步确认各指标的可靠性并找到最佳的抗旱鉴定指标，我们利用各性状的抗旱系数计算了各指标的隶属函数，再计算各品种的抗旱性度量值D，将各性状的抗旱系数与抗旱性度量值D进行相关性分析。如表4所示，大部分指标的抗旱系数与D值呈显著正相关。其中，脯氨酸抗旱系数的相关系数最大(0.745**)。按照相关系数的大小进行排序，其它性状依次为：POD活性>地下干重>地下鲜重>地上鲜重>CAT活性>地上干重>LRWC。另外，叶面积和SOD的抗旱系数均与D值相关不显著。以上结果表明，叶片相对含水量、地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、CAT、POD和脯氨酸含量均可以作为鉴定油菜苗期抗旱性的辅助指标。

表4 油菜苗期各性状的抗旱系数(DRC)与其抗旱度量数D值的相关系数矩阵

2.3 油菜苗期抗旱性品种的筛选

干旱胁迫后将各性状的抗旱系数利用公式计算相对应的隶属函数值，再计算各品种所有性状的抗旱性度量值D，综合比较各品种抗旱性。如表5所示，将79份材料的D值做了排序，D值越高，表明品种的抗旱性越好，以0.5作为阈值，将D值大于0.5的品种划分为抗旱品种，将D值小于0.3的品种划分为干旱敏感品种，将D值介于两者之间的划分为中度抗旱品种。由表5可知，79份材料根据D值可以划分为39个干旱敏感品种、8个抗旱品种、32个中度抗旱品种。

表5 79份油菜苗期抗旱性D值

2.4 干旱胁迫下不同基因型油菜的叶片温度和SPAD值变化

利用两个抗旱品种(编号为T-57和T-9)和两个干旱敏感品种(S-7和S-41)比较不同胁迫程度下各叶片温度抗旱系数的变化。由图2A可以看出，4个品种基于叶片温度的抗旱系数整体上呈上升趋势。经过1 d浓度为2.5%的PEG 6000适应性处理后，各品种的叶面温度都明显下降。这可能是由于植物在遭遇干旱时，气孔扩大、蒸腾作用加快、叶片表面的热量被水分带走，从而促使叶片温度下降。随着处理时间的延长以及干旱胁迫程度的递增，各品种的叶面温度逐渐上升，其中抗旱品种上升幅度要大于干旱敏感品种。这可能是因为抗旱品种在遭遇干旱时，为了抵御干旱胁迫，减少气孔开幅，减少蒸腾速率，进而叶片表面温度上升更快。在干旱胁迫处理前，抗旱品种的温度高于敏感品种；经过6 d的干旱胁迫，抗旱品种的叶面温度仍然高于干旱敏感品种，似乎表明叶面温度也可以间接反映出油菜材料抗旱性差异。

4个品种基于叶片SPAD值的抗旱系数的变化规律与叶面温度抗旱系数相似(图2B)。随着胁迫时间的延长、PEG 6000处理浓度的递增，4个品种的叶片SPAD值都呈显著的上升趋势。经过1d 5%浓度的PEG6000处理后其上升趋势明显加大。直接观察叶片会看到叶片颜色逐渐加深，甚至有的出现深绿色。比较干旱品种和敏感品种发现，干旱品种SPAD值抗旱系数上升幅度要大于干旱敏感品种。

其中，抗旱品种T-57 SPAD值上升了53.1%，敏感品种S-41 SPAD值上升了31.7%。这可能是由于抗旱品种为了抵御干旱，通过增加叶片中叶绿素含量，提高光合作用速率，来维持油菜的生长和发育。

2.5 油菜苗期干旱存活率试验

对79份材料进行苗期干旱存活率试验，在土壤水分含量低于5%时复水，测定各品种的存活率，进而比较各品种之间的抗旱性差异。干旱胁迫条件下，将部分抗旱品种和部分干旱敏感品种的干旱存活率列于表6,干旱存活率越高的品种其抗旱性越好。由表6可以看出，抗旱品种T3、T57、T17、T9、T25、T71的平均干旱存活率分别为96%、61%、95%、88%、67%和85%，而干旱敏感品种的干旱存活率均低于30%。同时，干旱存活率与抗旱度量D值之间的回归分析表明两者之间具有显著的线性关系(图3)，线性回归方程的决定系数达到0.53(P<0.01)，表明干旱存活率也是评价油菜苗期抗旱性的良好指标。

表6 不同抗旱型油菜苗期干旱存活率/%

3 讨论与结论

作物的抗旱性是一个十分复杂的生理过程，干旱发生时，往往是多个性状同时发生复杂的变化。苗期是油菜生长的关键时期，此时鉴定油菜抗旱性具有时间短、重复性强、易于操作等优点。近年来，多个指标的综合评价在小麦[17]、甘薯[18]、芝麻[19]、苦荞[20]等作物抗旱鉴定中已普遍使用，可有效避免单一指标的片面性，成功筛选出耐旱优异种质。徐银萍等[21]研究发现抗旱度量值D与产量密切相关，以D值为评价指标能有效且客观地评价品种间的抗旱性差异。本研究利用抗旱系数法、隶属函数法得到抗旱性量度值(D值)。利用D值可以较为准确地衡量各指标的权重性与指标间的相互关系[19]。本研究以抗旱度量值D值为指标，将79份甘蓝型油菜材料划分为三个抗旱等级。

有关油菜抗旱指标的筛选，前人做了大量研究工作。白鹏等[22]对干旱胁迫下油菜蕾薹期的生理特征研究发现，SOD、POD、CAT、株高、水分利用率等性状可作为油菜蕾薹期抗旱鉴定的主要指标。Munns等[23]研究发现叶面温度与蒸腾强度显著负相关，因此可以利用叶面温度的变化来间接表示叶片气孔蒸腾速率的变化。本研究中，我们对不同干旱胁迫程度下叶面温度和叶片SPAD值做了分析，发现随着干旱胁迫时间的延长以及干旱胁迫强度的递增，抗旱品种和敏感品种的叶片SPAD值都呈显著的上升趋势。此外，随着处理时间的延长、处理浓度的递增，各品种的叶面温度先下降再逐渐上升，其中抗旱品种上升幅度要大于干旱敏感品种。本研究通过比较不同胁迫条件下各品种叶片温度的变化，发现抗旱性显著不同的4个油菜品种在胁迫初期抗旱品种和干旱敏感品种的叶面温度都显著上升；随着胁迫时间的延长，叶面温度上升幅度减小，抗旱品种叶面温度上升幅度高于敏感品种。这是由于植物在遭遇干旱时，为了减少叶面蒸腾消耗，气孔较早关闭或减少气孔开口幅度，防止叶片可能发生的水分亏缺和水势下降，进一步保证了光合作用的进行[24]。洪双等[25]采用反复干旱的处理方法，发现地上部鲜重抗旱指数、植株总鲜重抗旱指数和旱害指数3个指标可作为苗期抗旱性鉴定的有效评价指标。

然而，前人研究多侧重于单一综合评价指标，缺乏多种评价方式相结合，鲜见将综合抗旱指标与苗期干旱存活率进行比对分析，以验证各综合抗旱指标预测品种抗旱性的准确性。在本研究中，相关性分析表明各指标的抗旱系数与D值紧密相关，其中地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、POD和脯氨酸的抗旱系数均与D值呈极显著正相关。此外，D值还与CAT、地下干重、相对含水量的抗旱系数均显著正相关。进一步的回归分析表明，苗期干旱存活率与抗旱性度量值D之间存在显著的线性关系，说明干旱存活率也可以作为抗旱性快速评价的良好指标。综上，在油菜苗期抗旱性鉴定中，有针对性地测定与D值密切相关的指标，如地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、POD和脯氨酸可有效鉴定油菜种质资源的抗旱性，筛选获得极端抗旱材料。

另外，在油菜苗期相对含水量、地上鲜重、地上干重、地下鲜重、地下干重、CAT、POD和脯氨酸均可以作为油菜苗期抗旱性鉴定的辅助指标。