五子衍宗丸通过抑制GRP78 减轻EAE 小鼠持续的内质网应激

肖午帅樊慧杰李艳荣贾 璐孙梦瀛张 波尉杰忠肖保国施福东马存根*柴 智*

（1.山西中医药大学基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室/神经生物学研究中心，山西 晋中 030619；2.山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619；3.山西大同大学脑科学研究所，山西 大同 037009；4.复旦大学华山医院神经病学研究所，上海 200025；5.天津医科大学总医院，天津 300052）

多发性硬化是一种中枢神经系统自身免疫性疾病，其特征是遍布中枢神经系统炎性病变导致严重的神经功能障碍，脱髓鞘、轴突损伤和血脑屏障改变其病理学标志［1]。其发病机制可能是由于中枢神经系统内原存的病变，伴有的不同程度的炎症，导致髓磷脂慢性脱落，或是因外周T细胞进入中枢神经系统并与巨噬细胞和B 细胞一起攻击髓磷脂，使髓鞘乃至轴突产生病变［2]。实验性自身免疫性脑脊髓膜炎（EAE）是多发性硬化的成熟动物模型［3]。目前在用于治疗多发性硬化的药物中，部分能够预防炎性组织损伤，但均无法直接促进修复，且有一定的毒副作用［4]。

基于中医肾藏精生髓，上充于髓海之脑的理论，肾亏髓空被认为是多发性硬化的根本病机［5]。五子衍宗丸具有补肾填精充髓的功效。现代研究表明，五子衍宗丸能够提高大鼠机体免疫［6]。课题组前期研究发现［7-8]，五子衍宗丸能够通过抑制炎性反应发挥对多发性硬化的神经保护效应，且其有抗凋亡的作用。近来有研究［9]表明，二甲双胍能够下调内质网应激相关基因葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的表达，这或是其能保护由鱼藤酮诱导的帕金森病小鼠内巴胺能神经元的一个原因。二至丸通过下调内质网应激相关因子CHOP 和半胱天冬氨酸蛋白酶12（Caspase-12）的蛋白表达，改善帕金森病小鼠的运动和学习记忆功能［10]。五子衍宗丸是否可以减轻EAE 小鼠的内质网应激而发挥治疗作用？基于此，本研究将探讨五子衍宗丸对EAE 小鼠内质网应激的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 8～10 周龄C57BL/6 雌性小鼠24 只，体质量18～21 g，购于北京维通利华实验动物公司，动物生产许可证号SCXK（京）2016-0006。获山西中医药大学伦理委员会批准，实验操作严格执行国际动物实验方针。动物于无菌动物房（温度22～25 ℃，相对湿度40%～60%）进行1周适应性饲养，而后开展实验。

1.2 药物 五子衍宗丸含菟丝子（炒）、枸杞子、五味子（蒸）、覆盆子、盐车前子五种中药，购于太原市同仁堂药店（北京同仁堂股份有限公司，批号18035041，规格0.1 g/粒，成人用量口服，6 g/次，2 次/d）。将药丸研磨至细粉后，以0.9%生理盐水配制成0.32 g/mL 的五子衍宗丸药液备用。

1.3 仪器电泳仪（美国 Bio-Rad 公司，型号PowerPacTM）；酶标仪（德国Leica 公司，型号C-1150）；冷冻离心机（德国Eppendorf 公司，型号5840）；转膜仪（型号PowerPacTM）、凝胶成像分析仪（型号HOOD-Ⅱ）（美国Bio-Rad 公司）；冰冻切片机（型号CM1950）、正置显微镜（型号DM4000B/DFC450C）（德国Leica 公司）。

1.4 试剂 小鼠髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽35-55（MOG35-55）（上海强耀生物科技有限公司，批号9001）；结核分枝杆菌（美国Becton Dickinson 公司，批号231141）；百日咳毒素（美国Sigma 公司，批号231144）；完全弗氏佐剂（美国Alexis 公司，批号60301）；抗葡萄糖调节蛋白78蛋白抗体（批号GR3281962-1）、抗半胱天冬氨酸蛋白酶12蛋白抗体（批号GR3225341-3）、抗增强子结合蛋白同源蛋白蛋白抗体（批号GR3259414-5）均购自英国Abcam 公司。

1.5 模型制备 将MOG35-55溶解于0.9%NaCl 溶液，结核分枝杆菌于完全弗氏佐剂中溶解，后以针管混合器将二者以相同体积充分混合成油包水样乳剂，待静置后无分层方可使用。取该试剂（MOG35-55浓度为250 μg/只，结核分枝杆菌浓度为350 μg/只，0.1 mL/只）于小鼠背部脊椎两侧选取4 点进行皮下注射；免疫当日和48 h 后，对小鼠按每只300 ng/次的规格腹腔注射百日咳毒素。待其尾部肌张力下降，视EAE 模型制成。

1.6 动物分组及给药 根据其平均体质量按照随机数字表法将24 只小鼠均分为正常组、模型组、五子衍宗丸组。免疫后第3 天开始持续25 天灌胃，每天给正常组和模型组以50 mL/kg 的生理盐水，五子衍宗丸组给予每天16 g/kg 的五子衍宗丸药液，体积为每次0.5 mL/只［7]，每日2 次，早晚间隔12 h。

1.7 行为学观察 从免疫当天起，每日对各组小鼠进行临床神经功能评分。采纳国际通用5 分制［3]：0 分，无症状；1 分，尾张力消失，跛行；2 分，后肢无力，翻其可复；3分，后肢完全瘫痪，触其可动；4 分，后肢全瘫和前肢部分瘫痪；5 分，濒死或亡。症状介于两者之间则以均值计。

1.8 采样及检测 药物干预至第28 天，腹腔注射10%水合氯醛（8 mL/kg）麻醉，于每组中随机取4 只以0.9%生理盐水快速灌注，后以4%多聚甲醛缓慢灌流固定，提取脊髓，脱水包埋，再行液氮冷冻，制10 μm 厚的冰冻切片，4℃保存备用；取各组另4 只以0.9% 生理盐水进行心脏灌注，快速提取脊髓组织再低温研磨，高速离心，匀浆后提蛋白，定量备用。

1.8.1 苏木素-伊红染色检测脊髓组织炎性细胞浸润程度 水中浸泡脊髓切片10 min，继而室温苏木素染色12 min，流水速洗5 min，后于0.5%盐酸酒精中分化13 s，流水速洗2 min，伊红染色1～2 min，流水速浸6 min，再以梯度乙醇脱水，继而以二甲苯透明，用中性树胶进行封片，光镜下采集图片。

1.8.2 髓鞘染色检测脊髓白质脱髓程度 脊髓切片浸于95%乙醇中固定15 min，后浸于固蓝置60 ℃烤箱中孵育20 h，继而以95%乙醇溶液浸9 min，去离子水流洗5 min，0.05%碳酸锂快速浸10 s，再以70% 乙醇分化，重复此两步操作至能够清晰辨别出灰质，去离子水浸流6 min，以梯度乙醇脱水，再以二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下采集图片。

1.8.3 Western blot 检测GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表达 取组织蛋白，4 ℃条件下裂解组织，以BCA 法测定蛋白含量，再制蛋白上样缓冲液。以10%凝胶电泳，后以半干式转膜法转至硝酸纤维膜上。5%脱脂牛奶摇床封闭1.5 h，洗涤后以TBST 分别稀释GRP78（1∶100）、Caspase-12（1∶1 000）、CHOP（1∶200）和Tubulin（1∶10 000）一抗，4 ℃孵育过夜，次日洗涤后加入相应的HRP 耦联二抗（1∶10 000），室温进行2 h 孵育，TBST 漂洗，以ECL 试剂显色曝光条带，后计算灰度值并比较再统计。

1.9 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，组间比较用单因素方差分析（ANOVA），两两比较采用t 检验，若不符合正态分布或方差齐性，则采用非参数检验，P＜0.05 则认为其差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 五子衍宗丸对小鼠神经功能的影响 如图1 所示，模型组小鼠于免疫后第10 天开始发病，五子衍宗丸组小鼠于免疫后第14 天开始发病。模型组、五子衍宗丸组平均起病时间分别为（10.88±1.13）、（14.88±0.83）d，与模型组相比，五子衍宗丸组小鼠平均起病时间推迟（P＜0.01），平均最高神经评分分别为（3.44±0.32）、（2.38±0.35）分，五子衍宗丸组小鼠平均最高神经评分降低（P＜0.01）。

图1 五子衍宗丸对小鼠神经功能的影响（，n=6）

2.2 五子衍宗丸对小鼠脊髓影响炎性细胞浸润的影响 如图2 所示，正常组、模型组、五子衍宗丸组脊髓白质区炎性细胞浸润面积占整个脊髓面积的比值分别为（0.71±0.11）%、（3.07±0.39）%、（1.57±0.22）%。与正常组比较，模型组炎性细胞浸润增加（P＜0.01）；与模型组相比，五子衍宗丸组炎性细胞浸润减少（P＜0.01）。

图2 五子衍宗丸对小鼠脊髓影响炎性细胞浸润的影响（，n=4）

2.3 五子衍宗丸对小鼠脊髓髓鞘脱失的影响 如图3 所示，正常组、模型组、五子衍宗丸组髓鞘脱失面积与脊髓白质面积比值分别为（1.47±0.28）%、（9.43±2.47）%、（3.40±0.81）%。与正常组比较，模型组髓鞘脱失增加（P＜0.01）；与模型组相比，五子衍宗丸组髓鞘脱失减少（P＜0.05）。

图3 五子衍宗丸对小鼠脊髓髓鞘脱失的影响（，n=4）

2.4 五子衍宗丸对小鼠脊髓GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表达的影响 如图4 所示，与正常组比较，模型组脊髓组织GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表达均升高（P ＜0.01）；与模型组比较，五子衍宗丸组脊髓组织GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表达均降低（P＜0.05）。

图4 五子衍宗丸对小鼠脊髓GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表达的影响（，n=4）

3 讨论

多发性硬化是一种的中枢神经系统炎性变性疾病脱髓鞘疾病［11]。中医将肾虚视为多发性硬化的发病之本［12]。补肾方药对于多发性硬化患者临床症状的改善，及生活质量的提高，都具有积极影响［13]。现代研究表明，五子衍宗丸组分中枸杞子具有一定的抗凋亡作用［14]，五味子有抗内质网应激和抗炎作用［15]，菟丝子具有抗炎活性［16]。本研究结果显示，补肾经方五子衍宗丸可改善EAE 小鼠神经功能评分并可延缓起病时间。苏木素-伊红染色和髓鞘染色结果证实，五子衍宗丸能够抑制脊髓白质炎性细胞浸润和髓鞘脱失。

在多发性硬化发作之前或期间，炎性介质的刺激或因神经细胞试图再髓鞘时导致内质网上蛋白超负载［17]，可能会触发内质网应激。内质网应激通过未折叠蛋白反应来恢复内质网稳态［18]。内质网应激主调节器GRP78 与未折叠的蛋白质结合，同时与三个跨膜未折叠蛋白反应信号转导器解离，从而启动内质网应激的三条分支通路即肌醇需要酶1、PKR 样内质网激酶和激活转录因子6［19]。再髓鞘化和轴突的修复、再生的一个信号便是适当的内质网应激触发的未折叠蛋白反应［20]。持续的内质网应激能使未折叠蛋白反应激活炎症信号通路［21]甚至促进神经毒性和凋亡程序［22]。Caspase-12 和CHOP 是内质网应激的两条主要的细胞凋亡途径［23]。在内质网应激期间，钙稳态被打破坏，可以特异性地激活Caspase-12，而后启动相关级联反应［24]。未折叠蛋白反应的三条通路均能作用于CHOP，肌醇需要酶1 能够上调CHOP 转录因子表达［23]，PKR 样内质网激酶能够诱导ATF4 激活，而后激活CHOP，切割后的激活转录因子6 能够调节CHOP 的表达［25]。未折叠蛋白反应的三条通路的激活都会产生转录因子分别为激活转录因子6a、剪切转录因子X 盒结合蛋白1 和激活转录因子4，均能激活GRP78 基因，从而提高内质网正常折叠蛋白质的能力［17]。有研究发现，EAE 小鼠体内GRP78、Caspase-12 和CHOP 蛋白表达水平升高［26]。另有研究发现，缺乏GRP78 基因表达的小鼠能够导致少突胶质细胞丢失并加剧EAE 的发展［27]。在本实验中，EAE 小鼠的GRP78、Caspase-12、CHOP 蛋白表达水平同时升高，再结合其病理结果可知，EAE 小鼠此时GRP78 的高表达可被认为是持续的内质网应激标志物而非适度的内质网应激标志物，且可推测此时高表达状态下的GRP78 发挥的保护作用远不及由Caspase-12 和CHOP 产生的触发凋亡加重炎症的髓鞘脱失的作用，而这种持续的内质网应激亦是由GRP78 启动的。GRP78 对髓鞘细胞有保护作用，而由GRP78 启始的持续的内质网应激导致的病理作用是高表达的GRP78 的保护作用所不能弥补的。五子衍宗丸能够下调GRP78、Caspase-12 和CHOP 蛋白的表达，表明其可减轻持续的内质网应激，减轻对髓鞘损害本身也是一种保护髓鞘的表现。

综上，五子衍宗丸对EAE 小鼠具有一定的防治作用，这可能与通过抑制GRP78 的表达来下调持续的内质网应激有关。持续的内质网应激下的GRP78 可能是五子衍宗丸治疗多发性硬化的一个潜在的新的治疗靶点。这为今后深入探索内质网应激通路参与五子衍宗丸对EAE 小鼠的防治机制提供了研究基础，也为临床应用五子衍宗丸治疗多发性硬化提供了实验基础。