石榴皮半仿生提取工艺的优化

王京龙，史 磊，郑丹丹，张立华，王占一，王 飞，孙秀梅，刘紫璇

（1.枣庄学院，山东 枣庄 277160；2.山东中医药大学，山东 济南 250355）

石榴皮属于传统收敛固涩药，为石榴科石榴Punica granatum L.的干燥果皮，临床常用于久泻、久痢等症［1]。它富含鞣质等多种酚类成分［2]，具有抗菌［3]、抗病毒［4]、抗肿瘤［5]、抗氧化［6]、保护胃肠黏膜［7]等药理作用。

半仿生提取法是基于“灰思维”方式模拟人体胃肠环境，采用特定酸碱度水依次连续提取，从生物药剂学角度为口服给药制剂提供的一种新技术，被广泛应用于多种活性成分的提取［8-10]。石榴皮中鞣花单宁、没食子单宁等大分子物质［11]脂溶性差，口服给药后血液中几乎检测不到原型成分，而是以鞣花酸、没食子酸及其代谢产物为主［12-13]。采用半仿生法提取时，酸碱环境有利于鞣质的水解，增加鞣花酸等活性成分的提取率。

因此，本实验拟通过层次分析法（AHP）、基于指标相关性的权重确定方法（CRITIC）的混合加权来优化权重分配［14-15]，再采用均匀试验筛选最佳工艺参数，优化石榴皮半仿生提取工艺。

1 材料

Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置四元泵、VWD 检测器、柱温箱，购自美国安捷伦科技公司；UV-2600 紫外-可见全波长扫描仪，购自日本岛津公司；MSA-3.6P-0CE-DM 电子天平（百万分之一），购自德国赛多利斯公司；Vortex 2 涡旋混合仪，购自德国IKA 公司；N-1200BV-WD 旋转蒸发仪，购自东京理化器械株式会社；PHS-3C PH 计，购自上海雷磁仪器厂；3k-15 离心机，购自美国Sigma 公司。

石榴采自山东枣庄冠世榴园，经枣庄学院张立华教授鉴定为岗榴石榴Punica granatum L.，剥取果皮，阴干备用。没食子酸（B20851-20 mg，纯度≥98%）、鞣花酸（B21073-20 mg，纯度≥98%）对照品，均购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈、甲醇为色谱纯，均购自德国Merck 公司；磷酸为色谱纯，购自美国阿拉丁工业公司；其余试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 提取液制备 将石榴皮粉碎后取10～20 目之间的粉末15 g，调节溶剂pH 值，常压回流提取3次（用水量比例10∶8∶8，提取时间2∶1∶1），滤过，4 000 r/min 离心15 min，合并，定容至500 mL量瓶中，即得（编号SBE1～SBE9，质量浓度为30 mg/mL）。

2.2 没食子酸、鞣花酸含量测定

2.2.1 色谱条件 Hypersil ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相水（含0.4% 磷酸）（A）-（甲醇-乙腈）（1∶1）（B），梯度洗脱（0～11 min，3%B，检测波长270 nm，体积流量0.8 mL/min；12～25 min，30%B，检测波 长254 nm，体积流量1 mL/min）；柱温30 ℃；进样量20 μL。色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取没食子酸对照品2.00 mg，置于10 mL 量瓶中，超纯水溶解定容至刻度；精密称取鞣花酸对照品2.62 mg，置于10 mL棕色量瓶中，DMSO 溶解，超纯水定容至刻度。精密吸取上述2 种溶液各5 mL，涡旋振荡混合均匀，即得（没食子酸、鞣花酸质量浓度分别为0.10、0.13 mg/mL）。

2.2.3 供试品溶液制备 精密量取“2.1”项下提取液各5 mL，置于25 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜过滤，即得（编号A1～A9，质量浓度为6.0 mg/mL），-4 ℃下保存。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下对照品溶 液 2.0、5.0、10、15、20 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，得没食子酸、鞣花酸方程分别为Y=3 635.6X-3.214 6（R2=0.999 6）、Y=10 380X+750.5（R2=0.999 7），分别在0.2～2.0、0.26～2.620 μg 范围呈良好的线性关系。

2.2.5 日内精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液，同一天内在“2.2.1”项色谱条件下进样测定6 次，每次20 μL，测得没食子酸、鞣花酸峰面积RSD 分别为1.48%、0.67%，表明该方法日内精密度良好。

2.2.6 日间精密度试验 取“2.2.2”项下对照品溶液，每天在“2.2.1”项色谱条件下进样测定3 次，每次20 μL，连续3 d，测得没食子酸、鞣花酸峰面积RSD 分别为1.86%、2.35%，表明该方法日间精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取“2.2.3 项下供试品溶液（A1），于0、2、6、12、24 h 在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、鞣花酸峰面积RSD 分别为1.27%、1.96%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验 取“2.1”项下提取液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液（A1）6 份，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、鞣花酸峰面积RSD 分别为2.31%、2.49%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验 精密吸取“2.1”项下提取液（SBE1）5.0 mL，共6 份，精密加入没食子酸对照品0.15 mg 左右，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得没食子酸平均加样回收率为99.05%，RSD 为2.32%。精密吸取“2.1”项下提取液（SBE1）5.0 mL，共6 份，精密加入鞣花酸对照品1.5 mg 左右，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项下色谱条件进样测定，测得鞣花酸平均加样回收率为98.12%，RSD 为2.15%。

2.3 总酚含量测定

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取没食子酸对照品10.0 mg，置于10 mL 量瓶中，超纯水溶解，定容，即得（质量浓度为1.0 mg/mL）。

2.3.2 线性关系考察 精密吸取“2.3.1”项下对照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于25 mL 量瓶中，加入酒石酸亚铁溶液6 mL，摇匀后静置10 min，pH7.5 磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，静置30 min 显色，以0 管为空白，在540 nm 波长处用紫外分光光度计测定吸光度［16]。以吸光度为纵坐标（A），对照品质量浓度为横坐标（X）进行回归，得到方程为A=14.336X+0.000 9（R2=0.999 4），在0.008～0.048 mg/mL 范围内线性关系良好。

2.3.3 日内精密度试验 取“2.3.1”项下对照品溶液0.4 mL，按“2.3.2”项下方法测定6 次吸光度，测得其RSD 为1.52%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 日间精密度试验 取“2.3.1”项下对照品溶液，每天按“2.3.2”项下方法测定3 次吸光度，连续3 d，测得其RSD 为2.54%，表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验 精密吸取“2.2.3”项下供试品溶液（A1）1.0 mL，于0、2、6、12、24 h 按“2.3.2”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为2.50%，表明溶液24 h 内稳定性良好。

2.3.6 重复性试验 取“2.1”项下提取液，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液（A1）6 份，各取1.0 mL，按“2.3.2”项下测定吸光度，测得其RSD 为2.45%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验 精密吸取“2.1”项下供试品溶液（A1）1.0 mL，共6 份，精密加入没食子酸对照品0.37 mg 左右，涡旋混合，按“2.3.2”项下方法测定吸光度，测得总酚平均加样回收率为96.05%，RSD 为2.20%。

2.4 干浸膏得率测定 精密量取“2.1”项下提取液SBE1～SBE9各20.0 mL，置于已烘干至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，置于减压干燥箱中，80 ℃下反复干燥至恒重，测定干浸膏得率。

2.5 均匀设计 本实验对一煎pH（A）、二煎pH（B）、三煎pH（C）、提取总时间（D）采用U9（91×33）均匀设计表进行设计，结果见表1。

表1 均匀设计结果Tab.1 Results of uniform design

2.6 指标权重确定

2.6.1 AHP 法 结合石榴皮药效物质含量、药理作用强弱等方面，将各成分含量、干浸膏得率的权重分为4 个层次进行量化。由于石榴皮主要药效物质为鞣质等多元酚，其中鞣花酸、没食子酸活性较突出，故设定各指标主次顺序为总酚含量＞鞣花酸含量＞没食子酸含量＞干浸膏得率，构建成对比较优先判断矩阵，见表2。经层次分析后，权重系数分别为总酚含量49.180%，鞣花酸含量24.590%，没食子酸含量16.393%，干浸膏得率9.836%，随机一致性RI 值0.89，一致性比列因子CR=0.000＜0.10，表明指标优先比较判断矩阵满足一致性检验。

表2 各指标成对比较的优先判断矩阵Tab.2 Priority judgment matrices for paired comparison of various indices

2.6.2 CRITIC 法 CRITIC 法是客观反映指标权重的计算方法［15，17]，它通过线性插值处理将考察指标间的对比强度和冲突性体现出来，较主观赋分法更客观科学。将表1 数据进行线性插值处理，通过SPSS 17.0 软件计算指标之间的变异性（Si）、冲突性（δi）、综合权重（ci）、权重（ω），结果见表3。

表3 CRITIC 法所得各指标的参数Tab.3 Parameters for various indices obtained by CRITIC method

2.6.3 AHP-CRITIC 法 计算公式为综合权重其中ωAHP-ij表示AHP 法处理的权重值，ωCRITIC-ij表示CIRTIC 法处理的权重值，i 表示第i 个因素，j 表示第j 个样本。结果，总酚含量、鞣花酸含量、没食子酸含量、干浸膏得率的权重系数分别为46.68%、28.51%、14.44%、10.37%。

2.6.4 权重方法比较 将表1 数据分别用3 种权重系数进行计算，再通过SPSS17.0 软件进行相关性分析。结果，AHP 法与AHP-CRITIC 法的相关系数为0.997，CRITIC 法与AHP-CRITIC 法的相关系数为0.889，AHP 法与CRITIC 法的相关系数为0.908，均有显著相关性（P＜0.05）；但比较AHP法、CRITIC 法的权重系数时发现，两者相关系数为-0.174，相关性不显著（P=0.826＞0.05），表明2 种方法赋值反应的信息无叠加性。

2.7 提取工艺确定 将“2.2”至“2.4”项下各指标按公式进行标准化处理，其中x′i.j表示标准化后数值，xi.j表示样品液i 中成分j的含量，表示样品液i 中成分j 的平均值，sj表示成分j 的标准偏差，按“2.6”项下公式计算综合权重，再计算综合评分Y，公式为Y=总酚含量×46.68%+鞣花酸含量×28.51% +没食子酸含量×14.44%+干浸膏得率×10.37%。

通过SPSS17.0 软件，对表1 各指标标准化数值和综合评分Y 进行二次多项式逐步回归，得方程为Y=-3.428+0.079AD+0.034C2，P=0.006 ＜0.01，可知模型有统计学意义，并且一煎pH 值（A）、三煎pH 值（C）、提取时间（D）对提取效果有显著影响（P＜0.05）。将回归方程规划求解预测，得到最优工艺为A=6.0，B=7.36，C=9.0，D=4.0 h，预测值为Y=1.222 0。结合实际操作，确定一煎pH、二煎pH、三煎pH 分别为6.0、7.4、9.0，提取时间分别为2.0、1.0、1.0 h。

2.8 验证试验 将石榴皮粉碎（10～20 目）后称取15 g，根据优化工艺制备提取液，按“2.2”至“2.5”项下方法测定鞣花酸、没食子酸、总酚含量及干浸膏提取率，各指标按“2.7”项下方法处理，得到综合评分Y′，结果见表4。由此可知，Y′为1.251 8，与预测值1.222 0 接近，表明该工艺合理可行。

表4 验证试验结果（n=3）Tab.4 Results of verification tests（n=3）

3 讨论

石榴皮属于收敛固涩药，活性成分主要为鞣质类，以鞣花酸单宁、没食子单宁为主，但大量研究表明［12-13]，鞣质类大分子物质很难以原型吸收入血，在肠道酸碱条件下分解，入血成分大多为鞣花酸、没食子酸、尿石素类代谢产物［18]等小分子酚类物质。因此，本实验选择总多酚及其分解产物鞣花酸、没食子酸作为主要考察指标，发现在最优半仿生提取工艺下两者提取率分别达到相同条件下水提液的5、4 倍左右，表明该工艺提取后石榴皮中部分鞣质类成分转化成小分子酚类化合物，更有利于胃肠道快速吸收。

在HPLC 法测定鞣花酸、没食子酸含量时，采用可变波长梯度洗脱法，发现两者最大吸收波长分别为254、270 nm，由于后者含量较低，故前11 min选择270 nm，后13 min 选择254 nm，此时2 种成分峰形、分离度均较好。

中药提取工艺的优化要体现中医药整体观念，故必须选取多个指标进行综合评判。本实验将层次分析法（AHP）和客观赋值法（CRITIC）作混合加权处理，既能体现各指标对中药贡献度的差异，又可充分平衡各数据冲突性、变异性所带来的影响，较单一赋权法更具科学性。验证试验结果表明，所得最优工艺参数合理可行，可为石榴皮的进一步研究提供依据。