HPLC 法同时测定金水咳喘康胶囊中4 种成分

顾崇梅，郭华荣，李 瑶，陈慧洁

（酒泉市药品检验检测中心，甘肃 酒泉 735000）

金水咳喘康胶囊由黄芪、人参、肉桂、蛇床子、当归、沙参等13 味中药组成，长期服用可降低患者秋冬季慢性支气管炎发作次数、时间、程度，疗效理想，方中蛤蚧、人参、黄芪、蛇床子、金樱子、肉桂功效补肺益肾，纳气定喘，贝母、黄精、百合功效润肺健脾、止咳化痰，地龙、水蛭、当归功效活血逐瘀、涤清顽痰伏饮，但目前其质量标准仅停留在显微鉴别和贝母甲素、贝母乙素TLC鉴别上，不能全面反映其内在质量。本实验选择金水咳喘康胶囊君药黄芪、当归、肉桂、蛇床子中的主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷［1-3]、阿魏酸［4-6]、桂皮醛［7-8]、蛇床子素［9]作为指标，通过HPLC 法同时测定四者含量，以期为该制剂质量控制提供基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Waters e2695，配置DAD 检测器（美国Waters 公司）；MS205DU 电子天平［梅特勒托利多仪器（上海）有限公司]；KH-250DB 超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 毛蕊异黄酮葡萄糖苷（批号111920-201505，纯度97.1%）、阿魏酸（批号110773-201915，纯度99.4%）、桂皮 醛（批号110710-201217，纯度99.5%）、蛇床子素（批号110822-201710，纯度99.5%）对照品均购于中国食品药品检定研究院。金水咳喘康胶囊由酒泉市中医院提供，阴性样品为自制。乙腈为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇为分析纯（天津化学试剂厂）；水为屈臣氏蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent 5 HC-C18（2）色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.086%磷酸（B），梯度洗脱，程序见表1；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长260 nm（0～16 min）、303 nm（16～20 min）、322 nm（20～25 min）、303 nm（25～33 min）；进样量20 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为2.005 6、5.017 5、50.231 2、6.112 2 mg/mL 的贮备液，甲醇定容至刻度，即得（各成分质量浓度分别为0.100 3、0.501 8、5.023 1、0.305 6 mg/mL）。

2.2.2 供试品溶液 将胶囊去除囊壳，取内容物约6 g（相当于样品20 粒），精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 甲醇，称定质量，浸泡过夜后超声（350 W、50 kHz）处理1 h，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 根据处方及制剂工艺，分别制备缺黄芪、缺当归、缺肉桂、缺蛇床子的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验 取对照品、供试品、阴性样品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，供试品溶液中各成分均在对照品溶液相同保留时间处有色谱峰，分离度均大于1.5，阴性无干扰。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.2 线性关系考察 精密量取对照品溶液2、4、6、10、16、10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以峰面积积分值为纵坐标（Y），进样量为横坐标（X）进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of variouis constituents

2.3.3 检测限、定量限考察 以S/N=3 为检测限，S/N=10 为定量限，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素检测限分别为0.930 1、0.220 1、0.180 3、1.170 1 ng，定量限分别为3.100 3、0.733 7、0.601 1、3.900 3 ng。

2.3.4 耐用性试验 取同一份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素峰面积RSD 分别为2.19%、2.05%、1.85%、1.98%，保留时间RSD 分别为0.23%、0.18%、0.35%、0.41%，表明该方法耐用性良好。

2.3.5 中间精密度试验 取同一份供试品溶液，采用Agilent 1260、Waters e2695 色谱仪，以及Agilent 5 HC-C18、Waters Symmetry C18、InertSustain C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD，结果见表3，可知该方法中间精密度良好。

表3 各成分中间精密度试验结果Tab.3 Results of intermediate precision tests for various constituents

2.3.6 重复性试验 取同一批胶囊，按“2.2.3”项下方法制备6 份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD 分别为2.28%、1.82%、1.99%、2.15%，表明该方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、16、24 h 在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素含量RSD 分别为2.68%、2.11%、2.10%、2.35%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取同一批胶囊6 份，精密加入“2.2.1”项下对照品溶液（毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素质量浓度分别为0.501 4、0.301 1、0.803 7、2.139 3 mg/mL）各1 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表4。

表4 各成分加样回收率试验结果（n=6）Tab.4 Results of recovery tests for various constituents（n=6）

2.4 样品含量测定 取6 批胶囊，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，平行2 次，结果见表5。

表5 各成分含量测定结果Tab.5 Results of content determination of various constituents

3 讨论

3.1 流动相选择 本实验分别对甲醇-0.1%醋酸、乙腈-水、乙腈-0.086%进行梯度洗脱，发现前两者均不能同时检测出毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素，而乙腈-0.086%磷酸可以，并且达到了完全分离的效果，故选择其作为流动相。

3.2 检测方法选择 金水咳喘康胶囊药味多，组成复杂，单波长、多波长均无法有效排除不同成分之间的干扰，故本实验采用波长转换法［10-16]进行测定，效果理想。

3.3 检测波长选择 本实验采用DAD 检测器，对供试品、阴性样品溶液在190～400 nm 范围内进行全波长扫描，发现毛蕊异黄酮葡萄糖苷在200、260 nm处有最大吸收，其中260 nm 处响应值比较大，故确定为260 nm；阿魏酸在322 nm 处有最大吸收，同时在303 nm 处吸收也很大，而且色谱峰峰形更尖锐对称，故确定为303 nm；桂皮醛在190～340 nm 处均有吸收，虽然290 nm 处吸收最大，但322 nm 处阴性干扰最小，故确定为322 nm；蛇床子素在303、322 nm 处均有最大吸收，其中303 nm 处阴性干扰最小，故确定为303 nm。

4 结论

本实验首次建立HPLC 法同时测定金水咳喘康胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、阿魏酸、桂皮醛、蛇床子素的含量，该方法操作简便，结果准确，方法稳定，重复性好，可作为该制剂质量评价和控制的依据。