基于网络药理学分析当归补血汤防治放射性心肌损伤的作用机制

王洁，赵信科，李应东，刘凯*

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020)

0 引言

当归补血汤始载于《内外伤辨惑论》，出自金元四大家之一李东垣之手[1]，由黄芪和当归两味中药以5∶1比分组成，为补气生血之基础方，应用广泛。黄芪具有益气固表，托毒排脓之效，正气得复，毒邪则出，与药理学研究认为黄芪具有促进NK细胞活性、增强中性粒细胞及巨噬细胞吞噬功能从而提高机体免疫力，并减轻有毒药物的毒性作用一致[2]。当归具有补血活血、调经止痛之功，现代实验研究证明当归具有改善血液系统活力等作用[3]。方中重用黄芪一为补气而固表，即“有形之血不能速生，无形之气所当急固”之理，二为有形之血生于无形之气，故用黄芪大补脾肺之气，以资化源，使气旺血生，配以当归养血和营，则浮阳敛收，阳生阴长，用于治劳倦内伤，阴血亏虚，阳浮于外之虚热证。近年来，随着对当归补血汤研究的深入，其应用范围不断增大，已有文献证明从当归补血汤在血液系统[4]、免疫系统、内分泌系统[5]等的运用，其治疗心血管疾病主要是集中在抗心力衰竭、抗动脉硬化、抑制心肌细胞凋亡、减轻心肌纤维化[6]等方面。但由于中药复方有效成分复杂，可以通过多成分、多途径、多靶点、协同来发挥药效，因此当归补血汤治疗放射性心肌损伤的作用机制仍有待进一步阐明。

近年来，随着胸部恶性肿瘤如食管癌、肺癌、乳腺癌、纵隔肿瘤的发生率不断增高，胸部放射治疗成为其治疗的主要治疗措施，而邻近纵隔的心脏在放疗时会不可避免地受到影响，引起不同程度的心脏损伤[7-8]。主要包括放射后心包损伤、心肌损伤(radiationinduced heart disease，RIHD) 、冠状动脉损伤、心脏传导系统损伤及心脏瓣膜损伤等，统称为放射性心脏损伤或放射性心脏病[9-10]。研究表明，经放射治疗后的肿瘤患者患冠心病、心脏瓣膜病、心包疾病、猝死等疾病的风险增加[11]。传统医学中的未病防治，增强机体正气，防御外邪是早期防治癌毒的方法，其在肿瘤的早期防治、减轻患者放化疗后副作用及改善生活质量方面具有一定的优势，即中医所说的减毒增效。

网络药理学是一种基于系统生物学理论分析药物作用机制的网络分析方法，具有整体性优势。它旨在从系统生物学、生物网络平衡的角度解释疾病的产生及从整体、从分子层面认识药物的作用机制[12]。中药复方治疗疾病的作用机制十分复杂，具有多成分、多途径和多靶点等优势，与中医的整体观念相当契合[13]。当前在中医药领域运用网络药理学研究中药复方的作用机制已成为趋势，大量研究均已取得了优秀的成果[14-16]。故本研究基于网络药理学研究方法，从分子角度证实当归活血汤治疗RIHD的可能活性成分，为后续中药复方的研究、临床新药的开发提供可借鉴的思路与方法。

1 资料与方法

1.1 当归补血汤的成分及作用靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台网站[17](TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)分别输入当归补血汤所含中药(当归、黄芪)，获得中药成分、口服生物利用度(oral bioavailability，OB)、药物相似性(drug-likeness，DL)以及作用靶点信息，以OB≥30%，DL≥0.18 作为筛选标准，获得有效成分。

1.2 有效成分作用靶点的获得

在TCMSP 网站中获得药物有效成分的作用靶点，通过Uniprot (https://www.uniprot.org/)平台校正其名称，利用SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 数据库[18]进行有效成分作用靶点的补充完善。

1.3 RIHD疾病靶点的获得

在 Therapeutic Target Database[19](TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)，Drugbank(https://www.drugbank.ca/)等网站共同检索RIHD相关靶点信息并进行整合。

1.4 蛋白质相互作用网络构建

将筛选后的有效成分所对应的靶点与疾病相关靶点进行匹配，共同靶点在STRING数据库(https://string-db.org/)中建立蛋白质相互作用PPI网络。Cytoscape3.2.1[20](http://www.cytoscape.org/)软件进行当归活血汤主要有效成分、靶点、通路之间的网络分析。

1.5 GO功能富集分析与KEGG通路分析

采用 Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery v6.8 数 据 库[21](DAVID，https://david.ncifcrf.gov/)对 PPI 网络中的蛋白质进行GO生物学功能富集分析和KEGG[22]通路富集分析。

1.6 成分-靶点-信号通路网络构建

将筛选出的当归补血汤成分与与其相关联的重要交集蛋白及KEGG 富集出生物通路的相互作用信息，上传到Cytoscape 3.2.1 软件中，利用Merge功能构建出成分-靶点-信号通路网络图。

2 结果

2.1 当归补血汤有效成分

在TCMSP数据库内检索以OB≥30%，DL≥0.18 的标准进行筛选后共得到 22个有效成分(表 1)。当归2个，包括β-谷固醇、豆甾醇；黄芪20个，包括黄芪甲苷、异鼠李素和菲-3-酚等。

2.2 在Cytoscape 3.2.1软件中导入当归补血汤的活性成分预测其作用靶标，构建活性成分-心肌损伤靶点网络图见图1。

如图1所示，此网络共包括114个节点，183个边。不同的节点代表当归补血汤潜在的活性成分与作用靶点。当归补血汤中共筛选出22个化合物，其中hederagenin、isorhamnetin及isoflavanon等 5个成分在 TCMSP 数据库中未检索到相应作用靶点，所以在成分-靶点网络图中未显示。自由度是反映节点重要性的指标，成分节点的度越大，表示该成分参与的生物功能越多，生物学重要性越强。对图1 分析可得出当归补血汤的重要核心成分包括β-谷固醇(betasitosterol，MOL000358)、豆 甾 醇(Stigmasterol，MOL000449)、黄芪甲苷 (formononetin，MOL000392)等。发挥作用的重要靶点以3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase，HMGCR)、前列腺素 G/H 合成酶 1、2(Prostaglandin G/H synthase 1、2)为主，PTGS1、PTGS2可能是其发挥药效的关键靶点。

图1 当归补血汤主要活性成分——靶点网络图

2.3 放射后心肌损伤 PPI 网络

在CTD、Drugbank数据库中输入RIHD名称，找出相关的蛋白193个，经筛选得出98个与当归补血汤成分作用靶点相交集蛋白。将相互作用关系数据导入 Cytoscape 3.2.1 软件，得到蛋白相互作用PPI 网络，见图2。图2中包括98节点，457条边，图中自由度值越大则节点颜色越深，结果提示当归补血汤治疗RIHD的靶标中自由度值排名前5的靶蛋白为原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src SRC)、前列腺素 G/H 合成酶2(PTGS2)、血清载脂蛋白百度A1(ApoA1)、白介素1β(IL1b)、雌激素受体α蛋白由基因(ESR1)。

图2 放射性心肌损伤 PPI网络图

2.4 GO生物过程和KEGG代谢通路富集分析

2.4.1 GO富集分析

通过运用 DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)平台，根据P值标准，将104个GO生物过程进行排列，发现当归补血汤治疗RIHD的作用靶点涉及不同类型的生物学过程。主要涉及蛋白氧化、细胞增殖的正向调节、水解酶活性的负调控、脂质分解代谢过程的正向调节、甘油三脂、胆固醇体内平衡、炎症反应、脂蛋白代谢过程、反向胆固醇运输、高密度脂蛋白粒子重构、磷脂酰胆碱代谢、信号转导等。

2.4.2 KEGG 通路富集分析

通过运用 DAVID 对当归补血汤作用靶点及RIHD交集靶点进行富集分析，设定P＜0.01，共获得相关通路37条，主要涉及PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、花生四烯酸代谢通路、癌症的中心碳代谢通路、雌激素信号通路、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路、cAMP信号通路、血小板活化通路、cGMP-PKG信号通路等。

2.5 有效成分-靶点-信号通路构建

利用 Cytoscape 3.2.1 软件中的 Merge 功能构建活性成分-作用靶点-代谢通路网络，如图3。

图3 GO 富集分析结果-log10(P-Value)

图4中包括当归补血汤核心成分 7 种，用三角形表示，RIHD重要靶点42个，用圆形表示；信号通路10条，用菱形表示。成分-靶点-信号通路网络显示，所预测出当归补血汤治疗RIHD 7 种潜在的活性成分与ESR1、SRC、ApoA1、IL1β及 PTGS2 等 42 个 靶蛋密切相关，通过PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、花生四烯酸代谢通路、雌激素信号通路、钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路、cAMP信号通路、血小板活化通路、cGMP-PKG信号通路等多条信号通路参与调控RIHD发病过程的不同环节。

图4 当归补血汤主要活性成分-靶点-信号通路网络图

3 讨论

本研究基于网络药理学理论初步筛选出当归补血汤治疗RIHD的有效成分包括β-谷固醇、豆甾醇、黄芪甲苷(formononetin，MOL000392)等 17种化合物，提示黄芪甲苷、豆甾醇是当归补血汤发挥作用的主要成分。研究表明，黄芪甲苷通过影响心肌细胞肥大，抑制心肌细胞纤维化和细胞凋亡来改善心肌重塑，保护心肌[23]。实验证实黄芪甲苷能降低高脂大鼠心肌缺血再灌注的损伤，其作用机制可能与黄芪甲苷及人参皂苷 Rg1降低炎症反应、抑制PINK1-Parkin介导的线粒体过度自噬相关[24]。豆甾醇是心血管疾病的独立有效危险因素，其蓄积会导致左心室功能障碍，心脏间质纤维化和巨噬细胞浸润而不引起动脉粥样硬化，并增加死亡率[25]。

基于PPI相互作用网络分析药物-疾病交集靶蛋白得到5个重要关键靶点为原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src(SRC)、前列腺素 G/H 合成酶2(PTGS2)、血清载脂蛋白A1(ApoA1)、白介素1β(IL1β)、雌激素受体α蛋白由基因(ESR1)，由此说明本方的核心成分可通过以上5个核心靶点发挥抗RIHD的作用。所预测出当归补血汤治疗RIHD中17种潜在的活性成分与IL1β、ApoA1、ESR1 及前列腺素内源性过氧化物合酶(PTGS1，PTGS2)等5种蛋白存在较强的相互作用。

通过对药物-疾病-靶点富集分析发现，当归补血汤的作用涉及多个生物学过程，主要有蛋白氧化、细胞增殖的正向调节、水解酶活性的负调控、脂质分解代谢过程的正向调节、甘油三脂、胆固醇体内平衡、炎症反应、脂蛋白代谢过程、反向胆固醇运输、高密度脂蛋白粒子重构、磷脂酰胆碱代谢、信号转导等生物过程。通过分析富集的 KEGG 通路可以发现，靶点基因主要集中在PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、花生四烯酸代谢通路、雌激素信号通路、神经活性配体-受体相互作用通路、cAMP信号通路、血小板活化通路、cGMP-PKG信号通路等多条信号通路。研究表明，PI3K/AKT信号通路与细胞生长、炎性反应以及细胞凋亡有着重要联系。PI3K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，参与细胞的能量代谢、增殖、分化以及凋亡[26]；有文献指出，缺血后处理保护心肌其机制可能是通过再灌注损伤补救酶(RISK)途径中细胞内生存途径磷酸肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(AKT)途径的激活(磷酸化)抑制凋亡的线粒体途径[27]。由此可见，当归补血汤中有效成分通过作用于多个靶点、调控多条信号通路，从而达到治疗RIHD的作用。祖国医学认为正气不足是疾病发生的重要原因之一，正所谓“正气存内，邪不可干”，正气不足可导致机体免疫功能低下，从而使“外邪”易于侵袭机体，病情迁延，难以痊愈，增强正气、提高机体免疫功能是祖国医学治疗疾病的优势之一。而当归补血汤具有扶正驱邪，补益气血，减毒增效之功，能有效延长能患者生存时间、减少放化疗不良反应并且提高机体免疫力，从而达到治疗RIHD的目的。

综上所述，本研究通过网络药理学方法从分子层面预测当归补血汤的豆甾醇、黄芪甲苷等2个成分主要通过调控PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路共同参与机体氧化、细胞增殖的正向调节、炎症反应、脂蛋白代谢过程、磷脂酰胆碱代谢、信号转导等过程，协同治疗RIHD，证实了中药复方是通过多靶点、多层面联合调控疾病的发生过程。本研究虽然为当归补血汤治疗RIHD提供了科学的理论支持，为复杂的中药体系提供了研究思路，但仍存在明显不足之处，缺乏需要临床观察研究和药理实验的后期验证。

表2 37条KEGG相关通路