响应面法优化霞多丽与赤霞珠混合酿造葡萄酒工艺

黄志芸，史金涵，霍归国，杜欣芮，张 继,

(1.西北师范大学生命科学学院, 甘肃兰州 730070；2.甘肃省特色植物有效成分制品工程技术研究中心, 甘肃兰州 730070)

桃红葡萄酒，又名玫瑰红葡萄酒，是口味和颜色上介于红、白两者之间的葡萄酒，同时具备红、白葡萄酒的特点，酒体轻盈，口感清爽，近年来非常受消费者的欢迎[1-2]。桃红葡萄酒主要是将葡萄浆果进行浸渍[3]，通过控制浸渍时间和温度，使得适量的花色苷和单宁等物质浸入到果汁中，并通过发酵、过滤、澄清、陈酿等工艺酿造而成。

近年来，中国已成为葡萄酒的生产和消费大国[4]。面对进口葡萄酒激烈的市场竞争，国内葡萄酒企业迎难而上，不断壮大。伴随消费需求的个性化和多元化不断增强，消费者对于新种类果酒产品的需求日渐高涨[5-6]。但是，我国与传统产酒国相比，葡萄酒品类单一，以红葡萄酒为主，桃红葡萄酒市场占有率极低，导致市场上葡萄酒风格的同质化，背离了葡萄酒的个性化和多样化的产品属性[7]。

目前，国内对于桃红葡萄酒的研究主要集中在以美乐、巨峰、赤霞珠和玫瑰香等单一品种发酵方面，单一品种通过浸渍发酵或浸渍压榨后进行清汁发酵酿造桃红葡萄酒。操庆国等[8]以巨峰葡萄为原料，控制初始总糖含量150 mg/L和总二氧化硫浓度80 mg/L，在18 ℃下浸渍发酵3 d，经澄清、陈酿后酒体颜色最佳，呈玫瑰红色；伍国明等[9]以赤霞珠为原料，在浸渍果浆的SO2质量浓度为80 mg/L，酵母添加量0.2 g/L，果胶酶添加量0.07 g/L时，低温15 ℃下浸渍26 h，经常规工艺处理后得到的桃红葡萄酒香气突出，酒体协调；孟强等[10]以“媚丽”为原料，考察浸渍温度、酒精发酵温度和是否进行苹果酸乳酸发酵(malolactic fermentation，MLF)对桃红葡萄酒的影响，结果表明，当低温浸渍、常温酒精发酵且不进行乳酸发酵时，桃红葡萄酒的综合得分最高；崔艳等[11]以玫瑰香为低温浸渍原料，考察浸渍温度和时间对低醇桃红葡萄酒品质的影响，结果表明，当浸渍温度6 ℃，浸渍时间48 h时所酿造的葡萄酒呈浅桃红色，口感均衡，低温浸渍增加了低醇葡萄酒的水果香和花香。国外桃红葡萄酒的研究比较流行的方法有Ripasso 法和“放血法”(saignée)。Lukic'等[12]采用Ripasso 法向葡萄醪液添加不同比例葡萄皮的方式控制葡萄酒的色度、香气和酚类物质；Leticiam等[13]考察不同“放血”比例对桃红葡萄酒品质的影响，结果表明，随着“放血”比例的增加，桃红葡萄酒的亮度增加，香气更浓郁，抗氧化性能更高。

混酿法是将两种或两种以上的葡萄原料按照一定比例混合后，采用浸渍发酵或前期混合浸渍后压榨取汁进行清汁发酵。混合酿造技术可以避免单一葡萄品种酿造桃红葡萄酒时色度不易控制、酒体单薄、香气不足等现象。南海龙等[14]将压榨后的公主白和北冰红山葡萄清汁单独进行低温发酵，发酵后的原酒按照一定比例混合，经澄清、陈酿后得到的桃红山葡萄酒香气优雅、复杂性提升，并且该工艺操作简单，更容易控制桃红葡萄酒的色度；张如意[15]以新疆玛纳斯产区小芒森葡萄和贵人香葡萄为原料,研究了单品种酿造后调配和完全混合发酵技术对葡萄酒的品质的影响，结果表明，发酵前期调配混酿能够增加葡萄酒香气成分和促进酒体结构的融合,对于提高混酿葡萄酒的品质有积极作用。霞多丽酿造的酒其果香味淡雅细腻，回味悠长，是目前全世界最受大家欢迎的酿造白葡萄酒的白葡萄品种之一[16]。赤霞珠酿造的干红葡萄酒颜色较深、浓郁厚重[17]。单宁酸含量较高的赤霞珠混合一定比例的霞多丽可以柔化口感，增进酒体的平衡性和丰富性。因此，以霞多丽和赤霞珠为原料混合浸渍后酿造桃红葡萄酒，对丰富我国葡萄酒的产品种类、增加葡萄资源利用途径、提高葡萄酒产品的质量和竞争力，具有非常重要的现实意义。

本研究以霞多丽和赤霞珠为原料，采用混酿法酿造桃红葡萄酒，选取原料配比、浸渍温度和浸渍时间三个因素，以花色素苷含量和感官评分为评价指标，通过单因素和响应面试验，对桃红葡萄酒混合酿造工艺进行优化，以期为桃红葡萄酒的生产寻求新途径以及工业化生产提供一定的理论和实践数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

成熟度八九分的霞多丽和赤霞珠当季冷藏葡萄 产自河北张家口；白砂糖 市售；酵母 葡萄酒酵母EC1118，丹麦LALVIN；盐酸、乙酸、乙酸钠、柠檬酸、柠檬酸钠、亚硫酸钠、氯化钾、氢氧化钠、碘化钾、硼酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、甲醇 均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；次甲基蓝、酚酞(指示剂) 上海安普实验科技股份有限公司；菲林溶液甲、乙液 阿拉丁试剂网；果胶酶(35000 U/g)、偏重亚硫酸钾 烟台帝伯仕自酿机有限公司。

FAI1204B电子分析天平 山海精科天美贸易有限公司；0～40%vol酒精度计 武强县亿达仪表厂；温度计 零度仪器仪表有限公司；LC-DR-53B数显糖度计 上海力辰科技有限公司；SPHs-3c型精密pH计 上海理达仪器厂；LRH-250F生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 工艺流程 霞多丽、赤霞珠→分选→清洗→除梗破碎→调硫→静置浸渍→酶解(果胶酶)→皮渣分离→调节糖度→接种酵母→主发酵→倒酒陈酿→低温澄清→过滤→调配→杀菌→灌装→成品

操作要点：预处理：将两种葡萄手工除梗破碎，按照一定比例混合后，迅速加入10倍软化水溶解的偏重亚硫酸钾，以免葡萄汁发生氧化或者受到杂菌污染，二氧化硫添加量控制在150～250 mg/L[18]；静置浸渍：通过浸渍作用，可以将葡萄果皮中的花色素苷和单宁等物质浸出到葡萄果汁中，增加葡萄果汁的颜色和风味物质。在17～29 ℃条件下对混合葡萄浆浸渍15～27 h；加入果胶酶：在浸渍过程中加入0.02%的果胶酶(果胶酶使用前按果胶酶∶水=1∶10 的比例，在 35 ℃的温水中搅拌活化 30 min)，加速果汁的澄清和提高出汁率；皮渣分离：浸渍结束后进行粗过滤和榨汁，避免葡萄果皮中的单宁等物质浸出过度，影响葡萄酒的口感；调节糖度：添加适量白砂糖使得葡萄发酵液可溶性固形物含量达到24 °Bx；发酵：加入0.3 g/L葡萄酒酵母EC1118，将称好的酵母在38 ℃下使用酵母质量 10 倍的2%蔗糖水溶液进行 30 min活化，在14～26 ℃条件下进行主发酵，当液面平静不再产生气泡，残糖含量不再下降时，说明主发酵结束[19]；陈酿：将分离后得到的酒液在15 ℃下密封陈酿30 d，为避免氧化作用，应尽量满瓶封藏，以减少酒体和空气的接触；低温澄清：在陈酿后的酒液中加入皂土(用其质量10倍的水对皂土进行浸泡12 h)，在4 ℃条件下静置澄清15 d。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 不同原料配比对桃红葡萄酒酿造的影响 固定二氧化硫添加量200 mg/L，浸渍时间21 h，浸渍温度23 ℃，发酵温度20 ℃，考察霞多丽与赤霞珠在混合比例为0.5∶1、0.8∶1、1∶1、1∶0.8、1∶0.5时对桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分的影响。

1.2.2.2 不同浸渍时间对桃红葡萄酒酿造的影响 固定原料配比1∶1，二氧化硫添加量200 mg/L，浸渍温度23 ℃，发酵温度20 ℃，考察浸渍时间为15、18、21、24、27 h时对桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分的影响。

1.2.2.3 不同浸渍温度对桃红葡萄酒酿造的影响 固定原料配比1∶1，二氧化硫添加量200 mg/L，浸渍时间21 h，发酵温度20 ℃，考察浸渍温度为17、20、23、26、29 ℃时对桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分的影响。

每组实验测定3次取平均值，以桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分为指标，研究各个单因素对桃红葡萄酒发酵情况的影响，并确定最适单因素条件。

1.2.3 响应面试验 在单因素实验的基础上，选取原料配比A、浸渍时间B、浸渍温度C为考察因素，应用Box-Behnken实验设计原理，以感官评分Y为响应值，进行三因素三水平响应面分析实验，进一步优化酿造工艺参数，因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factors and levels in the response surface methodology

1.2.4 指标测定 花色素苷测定：pH示差法[20]；总酸(以酒石酸计)测定：电位滴定法；总糖(以葡萄糖计)、还原糖(以葡萄糖计)测定：直接滴定法；总黄酮：依据GB/T15038-2006测定[21]；酒精度测定：酒精计法[22]；挥发酸(以乙酸计)[23]。

1.2.5 感官评分 挑选15名经过专业酒类感官培训的成员组成感官品评小组，参照GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法，以及Martínez等[24]的方法，对桃红葡萄酒的色泽、香气、滋味、典型性进行感官评定，具体评分标准如表2所示(满分100分，作图时换算为10分制)。

表2 感官评分标准Table 2 Criteria of sensory evaluation

1.3 数据处理

采用Design-Expert 10进行响应面试验设计与分析，采用Excel、GraphPad Prism 8进行数据处理和图表制作。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 不同原料配比对桃红葡萄酒花色素苷含量与感官评分的影响 由图1可知，不同的原料配比直接影响桃红葡萄酒的花色素苷含量与感官评分，随着赤霞珠添加比例的增大，复合后的葡萄汁花色素苷含量不断增加，这是由于赤霞珠花色素苷含量较高所导致的；而感官评分随着赤霞珠添加比例的增大出现先升高后下降的趋势，但当两者比例在(1∶1)时，其感官评分最高，其后又出现了品质下降的现象。由于桃红葡萄酒要求其色泽不宜过深或浅，最佳颜色呈粉红色[25]，又因为在原料配比为1∶0.5时的感官评价低于0.8∶1，因此选取0.8∶1～1∶0.8范围的比例为宜，综合考虑以原料配比1∶1为最适条件。

图1 原料配比对桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分的影响Fig.1 Influence of raw material ratio on anthocyanin content and quality in rose wine

2.1.2 不同浸渍时间对桃红葡萄酒花色素苷含量与感官评分的影响 桃红葡萄酒中浸渍时间的长短会直接影响花色素苷和单宁的浸出量，进而影响到桃红葡萄酒的色泽和口感[26]。由图2可知，桃红葡萄酒的感官评分随着浸渍时间的延长呈现出先增加后减少的趋势，但是花色素苷的含量随浸渍时间的延长不断增加。当浸渍时间低于21 h时，花色素苷和感官评分随浸渍时间升高而升高；当浸渍时间高于21 h时，感官评分随浸渍时间延长而降低。原因是当浸渍时间过长时大量花色素苷浸出，使葡萄酒的颜色加深，口感的满足程度降低。当浸渍时间在21 h时，感官评价达到最高的8.6分，且浸渍时间18～24 h范围时桃红葡萄酒颜色最佳，所以选择21 h为最适浸渍时间。

图2 浸渍时间对桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分的影响Fig.2 Influence of immersion time on anthocyanin content and quality in rose wine

2.1.3 不同浸渍温度对桃红葡萄酒花色素苷含量与感官评分的影响 桃红葡萄酒中浸渍温度的高低会直接影响花色素苷和单宁的浸出速度，进而影响到桃红葡萄酒的色泽和口感[27]。由图3可知，桃红葡萄酒的感官评分随着浸渍温度的上升呈现出先增加后减少的趋势，而花色素苷的含量一直增加。当浸渍温度小于23 ℃时，花色素苷和感官评分随温度升高而升高；当温度大于23 ℃时，感官评分随温度升高而降低，这是因为是在大于23 ℃的条件下，花色素苷和单宁浸出速度加快，影响了桃红葡萄酒的色泽和口感，酒体颜色加深，失去桃红葡萄酒特有的粉红色泽，收敛性口感加重；浸渍温度在20～24 ℃范围时，感官评分在7.5分以上，花色素苷含量在80～120 mg/L，这对于桃红葡萄酒来说是比较适宜的，综合考虑选取浸渍温度23 ℃为最适条件。

图3 浸渍温度对桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分的影响Fig.3 Influence of immersion temperature on anthocyanin content and quality in rose wine

2.2 响应面试验优化结果

2.2.1 响应面试验设计与结果 在单因素实验结果的基础上，确定原料配比A、浸渍时间B、浸渍温度C为因素，以感官评分Y为响应值，采用Designexpert8.0软件设计三因素三水平响应面试验，结果见表3。

表3 响应面试验设计与结果Table 3 Response surface methodology design and results

2.2.2 回归方程拟合与方差分析 对表3试验数据进行多元回归拟合，得到原料配比A、浸渍时间B、浸渍温度C三个因素与感官评分的多元二次回归方程：

由表4回归方程方差分析结果可知，该回归模型显著性检验P<0.0001，表明多元二次模型具有极显著意义，失拟项P=0.1082>0.05，不显著，表明其他因素对模型的干扰影响小[28]，该回归模型拟合情况良好；总决定系数R2=98.34%和调整决定系数R2Adj=96.22%均大于0.9，说明预测值与实验值有较好的相关性[29]，因此，该回归方程能基本拟合桃红葡萄酒的实验结果，并能利用此模型对酿造工艺条件进行分析与预测。

表4 回归方程方差分析结果Table 4 Analysis of variance of regression equation

在此模型中，交互项BC、二次项A2、B2及C2均对感官评分的影响表现为极显著作用(P<0.01)，一次项C具有显著作用(P<0.05)；比较F值可知，各因素对复合桃红葡萄酒酿造工艺过程影响作用按主次顺序排列为：浸渍温度(C)>浸渍时间(B)>原料配比(A)。

2.2.3 响应面结果分析 响应面图是响应值对应的因素构成的三维空间在二维平面上的等高图[30]，可直观反映各因素的交互作用、最佳水平范围以及对响应值的影响[31]。以回归方程为依据，绘制各因素交互作用的响应面图，考察原料配比、浸渍时间和浸渍温度的交互作用对感官评分的影响，结果见图4。

交互图中的曲线坡度陡峭，等高线呈椭圆形，都表明该因素的交互作用对响应值的影响大[32]。由图4可以看出，随着浸渍温度的上升和浸渍时间的延长，感官评分呈现先升高后降低的趋势，等高线呈椭圆形状，且曲线坡度陡峭，说明浸渍温度和浸渍时间交互作用显著，与方差分析结果一致；随着赤霞珠添加量占比增大，感官评分明显增加且下降趋势明显，说明原料配比对感官评分影响明显高于其他指标，但与其他因素交互作用不明显。

图4 原料配比、浸渍时间和浸渍温度交互作用对桃红葡萄酒感官评分影响的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plot of the effects of feeding ratio, impregnation time and impregnation temperature on sensory score of rose wine

2.2.4 最佳工艺条件的确定与验证实验 通过Design Expert软件实验优化结果，综合考虑感官评分和花色素苷含量，得到最佳酿造工艺条件为原料配比0.994∶1，浸渍时间21.26 h，浸渍温度22.18 ℃，在此条件下预测最高感官评分为93.24，结合实际操作情况，将最佳参数修改为原料配比1∶1、浸渍时间21 h、浸渍温度22 ℃，按照此工艺参数进行三次平行验证实验，得到桃红葡萄酒感官评分91.00分，实验结果与预测值基本接近，说明此模型能够很好的模拟桃红葡萄酒的实际情况，证实了模型的有效性。

2.3 桃红葡萄酒的理化指标测定结果

由表5可知，按照优化后的酿造工艺生产的桃红葡萄酒还原糖含量(以葡萄糖计)1.78 g/L；总糖含量(以葡萄糖计)3.69 g/L；挥发酸含量(以乙酸计)0.46 g/L；总酸含量(以酒石酸计)5.42 g/L；酒精度12.8%vol；花色苷含量93.4 mg/L，总黄酮含量475.8 mg/L，果酒各项指标检测结果均符合GB/T15037-2006《葡萄酒》的标准要求。

表5 优化酿造工艺后桃红葡萄酒的各项指标Table 5 Indicators for rose wine after optimized fermentation process

3 结论

本试验将赤霞珠和霞多丽混合浸渍酿造桃红葡萄酒，研究了两者的添加比例、浸渍时间和浸渍温度三个方面对桃红葡萄酒花色素苷含量和感官评分的影响。通过单因素实验和响应面设计分析，确定了桃红葡萄酒的最佳酿造工艺参数为原料配比1∶1、浸渍时间21 h、浸渍温度22 ℃。在此条件下，桃红葡萄酒感官评分可达91.00分，与模型预测值93.24基本接近，证实了模型的有效性和可靠性，且各项基本理化指标均符合国家标准，混合酿造的桃红葡萄酒同时具备了霞多丽酒和赤霞珠酒的优点，与单一品种酿造的桃红葡萄酒相比，香气更加优雅，口感更加柔和，酒体复杂性提升，更容易受到消费者的青睐。说明混合发酵工艺能够提高桃红葡萄酒的质量，开辟桃红葡萄酒的酿造新途径，对于桃红葡萄酒的发展壮大有促进作用。