富氢水发芽糙米加工工艺及其品质研究

杨 丽，肖 斌，肖登荣，丁信文，曾 辉，宋立华,

(1.上海交通大学农业与生物学院，上海 200240；2.上海瀛丰五斗生态农业发展有限公司，上海 202179)

我国约有2/3的人口以加工精度较高的白米为主食。研究表明，长期食用精白米会增加患糖尿病的风险[1]。糙米是包含米糠、胚芽和胚乳的全谷物，较好地保留了聚集在糠层及胚芽中的各种植物化学物质，具有较好的营养特性，但糙米口感差，蒸煮费时，作为主食可接受度低[2]。将糙米加工成发芽糙米，不但可保留糙米原有的部分维生素、矿物质、膳食纤维等基本营养成分，还可通过生物转化作用有效富集γ-氨基丁酸(GABA)等活性成分，既可使糙米获得良好的功能特性，还可改善口感[3]。但不同的加工工艺条件对发芽糙米的功能活性成分影响有所不同。

目前，关于发芽糙米加工工艺的研究大多以富集GABA为主要目的[4-8]：肖君荣等[9]研究不同钙离子浓度、pH、谷氨酸钠浓度及发芽时间对发芽糙米中GABA产生量的影响；郑艺梅[10]研究了蒸馏水、壳聚糖和氯化钙溶液三种浸泡剂在不同时间、温度和pH条件下对GABA富集效果的影响。但现有可有效富集发芽糙米中GABA等活性成分的加工工艺大多较复杂，成本高，不易实现产业化生产；此外，发芽糙米中除主要活性成分GABA外，黄酮也是其中的活性成分，具有清除自由基、防止细胞衰老[11]、降低胆固醇[12]、预防癌症[13-14]等作用。如何进一步富集黄酮等活性成分的含量，以增强发芽糙米的生物学活性值得进一步研究。

富氢水(Hydrogen-rich Water，HRW)是利用纳米气泡混合等技术将氢气溶解在水中得到的富含分子氢(H2)的水，近年来在医学领域中的应用研究较多[15-18]，但在食品加工中应用较少。本课题组前期利用富氢水加工发芽黑大麦，发现其不但可显著提高黑大麦发芽效率，还可改变其他功能活性成分的分布及含量，提高发芽谷物的抗氧化活性，显著增加发芽黑大麦中植物酚酸的含量[19]。因此，本研究进一步将富氢水应用于发芽糙米的加工，在明确其最佳工艺条件的基础上，进一步研究富氢水对发芽糙米总黄酮含量、米糠结构及糊化特性等品质的影响。富氢水制备简单，成本低，本研究可为功能性发芽糙米的加工提供新的思路和转化应用技术。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

糙米(南粳9108) 上海光明集团瀛丰五斗生态农业有限公司提供；次氯酸钠、乙醇、三氯化铝、乙酸甲(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司；芦丁 萨恩化学技术(上海)有限公司。

LRH-150型培养箱 上海一恒科学仪器有限公司；NNBB-L01型氢水机 上海芮诺巴伯纳米科技有限公司；PL20型电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；THC型数控超声波提取机 济宁天华超声电子仪器有限公司；TA2910型差式扫描量热仪 美国威尔明顿TA仪器公司；VFD-2000型冷冻干燥机 上海比郎仪器制造有限公司；高真空镀膜仪 英国Quorum公司；低真空超高分辨场发射扫描电子显微镜 美国FEI公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糙米发芽工艺 糙米去除杂质后用自来水冲洗3次，加入0.1%的次氯酸钠溶液消毒15 s，消毒后清水冲洗数次，糙米放于烧杯中，加入糙米体积1.5倍的富氢水或普通纯水浸泡，浸泡期间每隔1～2 h更换一次水以保持有效氢浓度，浸泡结束放入恒温培养箱中萌发，待糙米长出1 mm左右芽长后取出。发芽糙米加工工艺单因素实验以糙米浸泡时间、发芽温度和富氢水浓度为关键影响因素，通过探究其对糙米发芽率的影响，明确上述影响因素的作用范围。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 浸泡时间的确定 设定发芽温度为25 ℃，富氢水浓度为1 mg/L，分别浸泡8、10、12、14、16 h，萌发24 h，获得不同浸泡时间下糙米的发芽率。

1.2.2.2 发芽温度的确定 设定浸泡时间为12 h，富氢水浓度为1 mg/L，发芽温度分别为20、25、30、35、40 ℃，萌发24 h，获得不同发芽温度下糙米的发芽率。

1.2.2.3 富氢水浓度的确定 设定浸泡时间为12 h，发芽温度为25 ℃，富氢水浓度分别为0、0.5、1、1.5、2 mg/L，萌发24 h，获得不同富氢水浓度下糙米的发芽率。

1.2.3 响应面优化试验 在单因素实验基础上，采用Box-Behnken(Design-Expert8.0.6)实验设计，以浸泡时间、发芽温度和富氢水浓度为三因素，糙米发芽势、发芽率和总黄酮的含量为响应值，设计三因素三水平响应面试验，因素和水平如表1所示。

表1 试验因素及水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.4 富氢水对发芽糙米理化特性的影响 在响应面优化的工艺参数条件下，进一步研究未发芽糙米、普通纯水发芽糙米和富氢水发芽糙米组的发芽势、发芽率、总黄酮含量、米糠表皮超微结构及发芽糙米热物性的变化。

1.2.5 测定指标

1.2.5.1 发芽势和发芽率计算 待糙米萌发至出现露白时(萌发约12 h后)取出，按如下公式计算糙米发芽势。

式中：j-露白种子数；N-实验种子总数。

待糙米萌发至芽长1 mm左右(萌发约24 h后)取出，按如下公式计算糙米发芽率。

式中：i-芽长1 mm左右种子数；N-实验种子总数。

1.2.5.2 总黄酮检测[20]将发芽糙米烘干磨粉后过80目筛，利用直接干燥法(GB5009.3-2016)检测未发芽糙米、普通纯水发芽糙米及富氢水发芽糙米的含水量分别为14.10%、16.72%和16.89%。称取0.2 g糙米粉末，置于50 mL离心管中，加入50%乙醇溶液4 mL超声浴(280 W，45 ℃)提取40 min，4000 r/min离心10 min取上清液，重复三次提取后合并上清液。取1 mL上清液于10 mL容量瓶中，加入2 mL三氯化铝溶液(0.1 mol/L)，3 mL乙酸甲溶液(1 mol/L)定容摇匀，室温下放置30 min，于420 nm处测定吸光度值，各样品平行重复3次。以标准曲线求样品的总黄酮含量，总黄酮含量以芦丁当量表示(mg/100 g)。

1.2.5.3 扫描电镜观察糙米米糠超微结构 取未发芽糙米和发芽12 h后的糙米冷冻干燥，用导电胶将干燥后的糙米固定在载物台上，高真空镀膜仪喷金30 s，用低真空超高分辨场发射扫描电子显微镜扫描样品并拍照。

1.2.5.4 糙米糊化特性检测[21]称取2 mg各处理组糙米粉置于铝坩埚中，加入4 μL去离子水，4 ℃冰箱过夜平衡，采用差式扫描热量仪(Differential Scanning Calorimeter，DSC)分析糙米热物性。扫描温度为20～100 ℃，扫描速率为10 ℃/min，载气体为氮气，氮气流速为20 mL/min，测定时以空坩埚作为对照。

1.3 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 20进行单因素方差分析，Graphpad Prism 6.01软件作图，Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken实验设计。实验数据均是三次以上的重复，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 浸泡时间对糙米发芽率的影响 由图1结果可知在本实验时间段内(8～16 h)，糙米发芽率随浸泡时间延长先上升后下降，浸泡时间为12 h糙米的发芽率达到最大值80.0%±0.8%。这可能是因为糙米发芽需要通过一定浸泡时间以获得发芽所需的水分条件，在此过程中内部酶被有效激活，使得糙米的发芽率随浸泡时间延长而增加[22-23]；但当水分条件已满足发芽所需时，继续浸泡会导致糙米组织结构变得松散，发芽所需物质从细胞内溶出，反而不利于糙米发芽，从而使发芽率降低[24]。综合考虑，浸泡时间选择12 h左右，后续试验考察的浸泡时间为11～15 h。

图1 浸泡时间对糙米发芽率的影响Fig.1 Effect of soaking time on germination rate of brown rice

2.1.2 发芽温度对糙米发芽率的影响 由于植物萌芽过程中参与代谢的酶活性受温度影响较大，因此发芽温度对糙米发芽率影响较大。图2结果显示，在20～30 ℃之间，糙米发芽率随温度升高显著增加，温度为30 ℃时发芽率达到最大84.8%±0.7%。继续增加温度，糙米的发芽率下降，且易霉变，因此，本实验中利用富氢水加工发芽糙米，选择温度范围在25～35 ℃之间。

图2 发芽温度对糙米发芽率的影响Fig.2 Effect of germination temperature on germination rate of brown rice

2.1.3 富氢水浓度对糙米发芽率的影响 图3结果显示，随着富氢水浓度的增加，糙米发芽率呈上升趋势，当富氢水浓度达到饱和浓度2 mg/L时，糙米发芽率达到最大79.4%±1.8%。由于氢气在水中的饱和度范围为1.6～2 mg/L，浓度保持时间约2 h。如果继续加压增加氢气溶解度，不但提高成本且安全性要求增加。因此考虑实际生产需求，本实验未继续增加富氢水浓度。氢气作为一种气体信号分子，在不同应用范围和条件下，其所需要的最佳作用浓度不同[25]。杨瑞怡等[26]利用400和800 ppb的富氢水栽培网室叶菜；刘丰娇等[27]研究0.9 mg/L的富氢水对黄瓜幼苗光合碳同化及氮代谢的影响。此外，Zhu等[28]研究发现50%的富氢水通过提高与根发芽相关酶(过氧化物酶、多酚氧化酶和吲哚乙酸氧化酶)的活性，显著增加万寿菊根的长度和数量。本研究中富氢水浓度对糙米发芽率的影响机制尚值得进一步研究。综合考虑，后续考察的富氢水浓度为0.5～2 mg/L。

图3 富氢水浓度对糙米发芽率的影响Fig.3 Effect of hydrogen-rich water concentration on germination rate of brown rice

2.2 响应面试验设计及结果

本研究利用单因素实验考察了浸泡时间、发芽温度和富氢水浓度对糙米发芽势和发芽率的影响，二者随自变量变化趋势相同，因此考虑到实际生产需求，首先以发芽率为主要因变量，建立高效的发芽条件参数范围，以此为基础设计响应面试验，进一步探讨高效发芽工艺条件下富氢水发芽糙米总黄酮含量的变化。因此，研究选择浸泡时间、发芽温度与富氢水浓度3个因素，以发芽势、发芽率和总黄酮含量为指标进行响应面优化分析。响应面Box-Behnken试验设计及结果如表2所示。

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Results of Box-Behnken experimental design

2.2.1 模型建立与分析 利用Design-Expert8.0.6对表2实验数据进行二次多项式回归拟合，得到糙米发芽势、发芽率、总黄酮含量对浸泡时间(A)、发芽温度(B)、富氢水浓度(C)的回归方程分别为：

发芽势(%)=72.16+1.30A+2.14B+1.10C+0.13AB+0.74AC+0.18BC-16.85A2-16.86B2-8.12C2

发芽率(%)=80.74+1.33A+2.38B+1.05C-0.71AB+0.13AC+0.13BC-21.20A2-4.90B2-0.66C2

总黄酮含量(mg/100 g)=159.09+26.24A-45.23B+11.04C+5.48AB-3.18AC-38.03BC-46.49A2+12.83B2-11.94C2

表3结果显示，模型中P<0.0001，表明该模型具有统计学意义，失拟项P=0.0671>0.05，不显著，说明回归方程拟合较好，模型稳定。回归模型的校正决定系数R2为0.9889，说明该模型能解释98.89%响应值的变化，实验值与预测值拟合较好，据有良好的代表性，表明该回归模型预测未知条件下浸泡时间、发芽温度及富氢水浓度对糙米发芽势的影响可行。回归模型的显著性分析结果可知，一次项B(发芽温度)对糙米发芽势有显著影响(P<0.05)；平方项A2、B2、C2对糙米发芽势有极显著影响(P<0.01)；F值表明，发芽温度对糙米发芽势的影响最大，其次为浸泡时间和富氢水浓度。

表3 发芽势回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model for the germination potential

表4结果显示，模型P<0.0001，表明该模型具有统计学意义，失拟项P=0.6548>0.05，不显著，说明回归方程拟合较好，模型稳定。回归模型的校正决定系数R2为0.9859，说明该模型能解释98.59%响应值的变化，实验值与预测值拟合较好，据有良好的代表性，表明该回归模型预测未知条件下浸泡时间、发芽温度及富氢水浓度对糙米发芽率的影响可行。F值显示，三因素对糙米发芽率影响大小的顺序依次为发芽温度、浸泡时间、富氢水浓度。回归模型的显著性分析结果可知，一次项B(发芽温度)对糙米发芽率有显著影响(P<0.05)；平方项A2、B2对糙米发芽势有极显著影响(P<0.01)；F值表明，发芽温度对糙米发芽率影响最大，其次为浸泡时间和富氢水浓度。

表4 发芽率回归模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model for the germination rate

表5所示为发芽糙米中总黄酮含量回归方程的方差分析，模型P=0.0384<0.05，表明该模型具有统计学意义，失拟项P=0.1040>0.05，不显著，说明回归方程拟合较好，模型稳定；回归模型的校正决定系数R2为0.8402，说明该模型能解释84.02%响应值的变化，实验值与预测值拟合较好，据有良好的代表性，表明该回归模型预测未知条件下浸泡时间、发芽温度及富氢水浓度对发芽糙米总黄酮含量的影响可行；A、BC、A2项对糙米总黄酮含量的影响显著(P<0.05)，B影响极显著(P<0.01)。实验范围内，三因素对糙米总黄酮含量的影响顺序为发芽温度>浸泡时间>富氢水浓度。

表5 总黄酮含量回归模型的方差分析表Table 5 Analysis of variance of regression model for the total flavonoid content

2.2.2 响应面交互作用结果分析 响应面图可以直观的看出浸泡时间、发芽温度和富氢水浓度的交互作用对糙米的发芽势、发芽率和总黄酮含量的影响。

由图4结果显示，浸泡时间与富氢水浓度对糙米发芽势影响的响应面坡度较为陡峭，等高线偏椭圆形且曲线较为密集，表明各交互项中浸泡时间与富氢水浓度对糙米发芽势的交互作用最大，而其他两组的交互作用曲线较平滑，这与方差分析结果相符。

图4 各因素交互作用对糙米发芽势影响的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the germination potential

图5结果显示，浸泡时间与发芽温度对糙米发芽率影响的响应面坡度较为陡峭，表明浸泡时间与 发芽温度交互作用对糙米发芽率的影响最大，这与表4结果相符。糙米发芽率随浸泡时间和发芽温度的增加呈现先上升后下降的趋势。

图5 各因素交互作用对糙米发芽率影响的响应面和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the germination rate

图6所示，发芽温度与富氢水浓度对糙米总黄酮含量的交互作用最显著，其次为发芽温度与浸泡时间，最后为浸泡时间与富氢水浓度，整体上，糙米总黄酮的含量随富氢水浓度的增加而增加。已有研究表明，富氢水中的氢气作为信号分子可以增加苜蓿中查尔酮合酶(CHS)、总黄酮醇合酶(FLS)和异总黄酮6-甲基转移酶(6IOMT)的转录水平，提高总黄酮类生物合成相关基因的转录水平，使总黄酮含量增加[29]。富氢水对发芽糙米总黄酮含量影响的分子机制还需进一步研究。

图6 各因素交互作用对糙米总黄酮含量影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots showing the effect of interactions among various factors on the total flavonoid content

2.2.3 回归模型的验证结果 根据模型优化结果和实际实验条件，在软件中设置三组指标权重相同，同时数值取最大值，获得利用富氢水加工发芽糙米的最佳参数条件为：浸泡时间13.18 h、发芽温度28.56 ℃、富氢水浓度1.51 mg/L，回归模型结果显示在此条件下糙米发芽势为69.51%、发芽率为79.87%、黄酮含量为181.31 mg/100 g。实际实验操作稍作条件修改为浸泡时间13 h、发芽温度29 ℃、富氢水浓度1.5 mg/L。对优化结果重复验证三次，该参数条件下糙米发芽势为67%±1%、发芽率为84%±2%，总黄酮含量为(186.5±7.1)mg/100 g。实验值与理论值拟合度高达95.6%以上，说明优化模型可靠。

2.3 富氢水对发芽糙米理化特性的影响

2.3.1 富氢水对糙米发芽势、发芽率和总黄酮含量的影响 图7结果显示，未发芽糙米总黄酮含量为37.8 mg/100 g。在浸泡时间和发芽温度相同的情况下，普通纯水处理组糙米的发芽势为46%±3%、发芽率为70%±2%，总黄酮含量为130.3±4.2 mg/100 g，富氢水处理组糙米的发芽势、发芽率和总黄酮含量极显著高于普通纯水处理组(P<0.01)。从图8普通纯水和富氢水处理糙米发芽24 h的实际发芽情况对比也可明显看出富氢水处理组糙米发芽率和芽长均显著优于普通纯水处理组。

图8 普通纯水与富氢水糙米发芽24 h情况对比Fig.8 Comparison of pure water and hydrogen-rich water on the germination rate of brown rice after 24 h

2.3.2 富氢水对糙米米糠超微结构的影响 利用扫描电镜观察未发芽糙米和各处理组发芽12 h糙米米糠超微结构，结果如图9所示。可看出，与普通纯水处理组相比，富氢水处理组糙米米糠更松散多孔。

2.3.3 富氢水对发芽糙米糊化特性的影响 图10为利用差式扫描量热仪分析糙米糊化特性的部分检测结果，具体数据如表6所示，从表中数据可看出利用富氢水加工发芽糙米，其糊化起始温度To、峰值温度Tp和终止温度Tc均低于未发芽糙米和普通纯水发芽糙米；富氢水发芽糙米的热焓值显著低于未发芽糙米和普通纯水发芽糙米(P<0.05)。这可能是因为富氢水处理组糙米米糠皮层较普通纯水处理组更松散，使得糊化时水分更容易进入籽粒内部[30]，从而使其蒸煮特性得到改善。这与扫描电镜结果一致(如图9所示)。随着温度的升高，富氢水发芽糙米中的淀粉颗粒膨胀更明显[31]，淀粉分子间的氢键作用减弱，较易糊化，这进一步表明利用富氢水加工发芽糙米可使其加工特性得到一定程度的改善。

图9 富氢水对糙米米糠超微结构的影响(2000×)Fig.9 Effect of hydrogen-rich water on the ultrastructure of brown rice bran(2000×)

图10 糙米DSC分析曲线Fig.10 DSC analysis curve ofbrown rice

表6 糙米DSC分析检测结果Table 6 DSC analysis results of brown rice

3 结论

本研究利用单因素实验和响应面试验，首先建立富氢水加工发芽糙米的优化参数条件为：浸泡时间13 h、发芽温度29 ℃、富氢水浓度1.5 mg/L，在此工艺条件下糙米发芽势、发芽率及功能活性成分总黄酮含量均明显提高；此工艺条件下富氢水还可较普通纯水更有效改善发芽糙米米糠层的松散程度及糊化特性，但产生上述变化的具体生物学机制尚有待进一步的研究。此外，富氢水是富含氢分子的活性

水，其制备工艺简单，成本低，具有抗氧化、抗炎等功能，在医学领域有较多的研究和应用，但目前在食品加工中的应用较少。本研究为功能性发芽糙米的加工及技术转化应用提供了新思路。