超声波-微波提取香蕉皮中抑菌物质的工艺优化

刘俊红，梅淑敏，郝朝阳，樊媛芳，洪 军

(河南城建学院 生命科学与工程学院，河南 平顶山 467036)

2010年中国香蕉总产量为948.8万 t，居世界第3位[1]。但香蕉属于呼吸跃变型水果，容易发生变质，且贮运和保鲜难，对香蕉进行深加工制成系列产品是提高其附加值的有效途径之一。但是对香蕉进行深加工的同时，会产生大量的香蕉皮(占果实总重量的25%～35%)。

研究结果表明香蕉皮中含有大量的果胶、膳食纤维、有机酸、蛋白质和脂肪，Zn、Fe、K、Ca、Mg的含量也相当丰富，极具开发价值[2]。因此，对香蕉皮进行综合开发利用，不仅可以保护环境而且还能创造更多的经济效益。目前已有相关文献研究利用香蕉皮提取膳食纤维、果胶及多糖等其他营养物质[3-5]，但是对于香蕉皮中抑菌物质提取和检测的研究报道较少。

超声波辅助提取是通过超声波产生的热效应、空化效应和机械作用，破碎原料的细胞壁，促进提取剂进入细胞内与目标提取成分充分混合，加快细胞内的物质溶出、释放以及扩散，从而提高提取效率[6]。

朱超峰等通过超声波辅助化学法提取香蕉皮中的多酚物质，多酚提取量为 25.29 mg/g。香蕉皮多酚物质的抗氧化活性随浓度增加而增强[7]。

研究显示，植物中的多酚和有机酸等有效成分不仅有抗氧化、预防心血管疾病发生、抗癌、抑菌消炎、抗病毒等作用，而且还可以作为食品添加剂以及酒类和饮料澄清剂[8-9]。从节约资源保护环境的角度考虑，对香蕉皮进行研究，可以提高香蕉皮的综合利用，变废为宝。

本文研究了从香蕉皮中提取抑菌物质的优化工艺条件，旨在制备一种经济有效、安全稳定的天然食品防腐剂，为进一步开发利用废弃香蕉果皮资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

称取一定量香蕉皮浸泡于浓度5%的柠檬酸溶液中5 min，之后用打浆机粉碎，用研钵研磨。

1.1.2 主要试剂

NaOH(分析纯)：天津市河东区红岩试剂厂；乙醇(分析纯)：洛阳市化学试剂厂；柠檬酸(分析纯)：天津博迪化工股份有限公司；琼脂(分析纯)：天津市大茂化学试剂厂；氯化钠(分析纯)：洛阳市化学试剂厂；酵母提取物(分析纯)：北京奥博生物技术有限责任公司；蛋白胨(分析纯)：北京奥博生物技术有限责任公司。

1.1.3 实验仪器

L530低速离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；MM721NH1-PW微波炉：广东美的厨房电器制造有限公司；九阳JYL-C012料理机：九阳股份有限公司；BCD-160TMPQ冰箱：青岛海尔股份有限公司；KQ5200DB型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；高压灭菌锅：上海富士工器有限公司；SHA-B/C恒温培养振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 单因素实验

以香蕉皮为实验原料，通过单因素实验研究影响香蕉皮中抑菌物质提取效果的各个因素(乙醇浓度、液固比、超声波功率、超声波时间、超声波温度等)对实验结果的影响。每个因素做五个梯度，三个平行。

(1)乙醇浓度对香蕉皮中抑菌物质提取的实验。

乙醇浓度：40%、50%、60%、70%、80% ，液固比101，超声波功率120 W、超声波时间40 min、超声波温度50 ℃，反应后放在微波中350 W处理60 s，之后离心(3 000 r/min，5 min)取上清液待测。

大肠杆菌(ATCC25922)的培养：将灭菌的液体培养基进行分装，每个试管用移液枪加4 mL，选择菌种与液体培养基1100的比例，在试管中接种保存的大肠杆菌菌种，37 ℃下恒温培养24 h，测定抑菌圈时将培养好的大肠杆菌使用无菌生理盐水配制成浓度为104～105CFU/mL(每毫升样品中含有的细菌群落总数)孢子或菌体悬浮液[10]。

抑菌圈直径大小的测定：采用滤纸片法，将直径为6 mm的滤纸片灭菌备用。将制备好的104～105CFU/mL菌悬液0.1 mL滴入到已加入培养基的培养皿中，使用灭菌玻璃棒均匀涂布，用无菌镊子将滤纸片均匀分散放入含菌平皿中，每皿中放入3片，每片上滴取5 μL提取液，将培养皿做好标记分别放入37 ℃培养箱中培养24 h，测量抑菌圈的直径。通过抑菌圈直径的大小来进行条件的选择[11-12]。

(2)液固比对香蕉皮中抑菌物质提取的实验。

(3)超声波功率对香蕉皮中抑菌物质提取的实验。

超声波功率分别为80 W、100 W、120 W、140 W、160 W，乙醇浓度60%、液固比101、超声波时间40 min、超声波温度50 ℃，重复(1)的实验操作步骤。

(4)超声波时间对香蕉皮中抑菌物质提取的实验。

超声波时间分别为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，乙醇浓度60%、液固比101、超声波功率120 W、超声波温度50 ℃，重复(1)的实验操作步骤。

(5)超声波温度对香蕉皮中抑菌物质提取的实验。

超声波温度分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃，乙醇浓度60%、液固比101、超声波功率120 W、超声波时间40 min，重复(1)的实验操作步骤。

1.2.2 正交实验

根据单因素实验的结果设计正交实验，研究从香蕉皮中提取抑菌物质的优化工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1乙醇浓度对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

乙醇浓度对香蕉皮中抑菌物质提取的影响见图1。

由图1可以看出：随着乙醇浓度逐渐增大，抑菌圈直径随之增大，其中50%～60%的乙醇浓度使得抑菌圈直径增速最明显，浓度超过60%之后抑菌圈直径呈现平缓趋势。

一方面，抑菌物质易溶解在乙醇中，随着乙醇浓度的增加，抑菌产物的溶解度增加直至达到饱和；另一方面，在植物体内抑菌物质一部分以游离的形式存在于液泡中，一部分以与蛋白质、多糖通过氢键或疏水键结合的形式存在于细胞壁中，当乙醇体积分数过高时，会使蛋白质变性，影响抑菌物质的溶出，故将乙醇浓度设定为60%。

2.1.2 液固比对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

液固比对香蕉皮中抑菌物质提取的影响见图2。

图2 液固比对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

从图2可知：随着液固比逐渐增大，抑菌圈直径先增加后减小，当液固比达到61后抑菌圈直径开始缓慢下降，说明抑菌物质的溶出量已达饱和，此后再增加液固比，原料被试剂所饱和，对实验结果没有显著影响，从节约溶剂的角度考虑，将液固比定为61。

2.1.3 超声波温度对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

超声波温度对香蕉皮中抑菌物质提取的影响见图3。

图3 超声波温度对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

从图3可知：随着超声波温度的逐渐升高，抑菌圈直径呈现先增加后减小的趋势。一方面，随着温度的增加，分子运动速率加快，抑菌物质的溶出随之加快；但当温度超过一定值时，抑菌物质会受到破坏，表现为抑菌效果减弱；另一方面，温度升高，加快了溶剂的挥发，抑菌物质的溶出量下降。当超声波温度达到40 ℃时，抑菌圈直径达到最大，故将超声波温度设定为40 ℃。

2.1.4 超声波时间对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

超声波时间对香蕉皮中抑菌物质提取的影响见图4。

图4 超声波时间对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

从图4可知：随着超声波处理时间的延长，抑菌圈直径呈现先增加后减少的趋势，即随时间的延续，超声波对物料的作用更加充分，从香蕉皮中提取的抑菌物质含量也逐渐增大，当超声波时间为20 min时抑菌圈直径达到最大，之后再延长超声时间会导致提取率逐渐下降，这可能是因为长时间超声振动使抑菌物质结构遭到破坏，此外超声处理时间延长也会增加能耗，因此将超声波时间设定为20 min。

2.1.5 超声波功率对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

超声波功率对香蕉皮中抑菌物质提取的影响见图5。

图5 超声波功率对香蕉皮中抑菌物质提取的影响

从图5可知：随着超声波功率的逐渐升高，抑菌圈直径呈现先增加后减小的趋势，说明随着超声波功率的逐渐升高从香蕉皮中提取的抑菌物质呈现先增加后减少的趋势。

随着超声波功率的增强，对细胞结构的破坏程度增强，加快了抑菌物质的溶出，但过高功率产生的机械效应和热效应会使抑菌物质遭到破坏；同时，对于一定量的原料来说，较高的功率会造成“空超”现象，多余的功率消散在反应液中增加了能耗，故将超声波功率设定为100 W。

2.2 正交实验

在单因素实验的基础上，利用正交分析软件设计正交实验，因素水平表见表1，实验结果见表2，正交实验均值见表3。

表1 正交实验因素及其水平

表2 正交实验结果

表3 正交实验均值表

通过表2正交实验结果分析可以看出：最佳的处理条件是A4B3C2D4E1，即当乙醇浓度为80%，液固比为81，超声波时间20 min，超声波功率140 W，超声波温度30 ℃时，抑菌圈直径达到最大，为9.23 mm。

由表3数据可以看出，影响实验结果最主要的因素是乙醇浓度，其次是超声波功率，影响最小的是超声波时间。

为确定最终的优化工艺，对正交试验直观结果和R值分析的结果进行验证实验，具体操作如下：A4B3C2D4E1，即将80%的乙醇按照液固比81的比例与香蕉皮混合放在超声波发生器中，设定超声波功率140 W、超声波温度30℃反应20 min，反应结束再经350 W微波处理60 s后离心取上清液，按照1.2.1中的方法测量抑菌圈直径。

A4B4C2D3E1，即将80%的乙醇按照液固比101的比例与香蕉皮混合放在超声波发生器中，设定超声波功率120 W、超声波温度30℃反应20 min、，反应结束再经350 W微波处理60 s后离心取上清液，按照1.2.1中的方法测量抑菌圈直径。

实验结果显示：A4B4C2D3E1与A4B3C2D4E1工艺下，抑菌圈直径分别为9.28 mm和9.26 mm，即A4B4C2D3E1为提取的最优工艺条件。

梁盛年，段志芳，方旺标等的实验结果表明：香蕉皮中含有酚类、油脂类、有机酸、缩合鞣质、蛋白质和糖类等化学成分。为了进一步探讨香蕉皮抑菌的有效成分，利用丙酮提取香蕉皮中的鞣质和酚性成分，用乙醚提取香蕉皮中的总有机酸，利用几种常见细菌如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌等菌种为供试菌做了初步抑菌试验(测量抑菌圈直径的大小)。实验结果表明：香蕉皮中的主要抑菌成分是有机酸[13]。

有机酸能进入大肠杆菌的细胞质，降低细胞内的pH值，影响参与代谢的相关酶的活性，进而抑制大肠杆菌的生长，达到抑菌的目的[14]。Gong Y等的研究认为有机酸可以与某些成分结合，如细胞膜上的脂多糖，导致细胞膜的稳定性被破坏，进而抑制大肠杆菌的生长[15]。

王虹玲等从香蕉皮中提取单宁的抑菌试验结果显示，单宁物质对细菌的抑制作用较强，但是对霉菌抑制作用不太明显，对酵母菌几乎没有抑制作用，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑制浓度(MIC)都为0.1%，对枯草芽孢杆菌的最低抑制浓度(MIC)为0.2%，对黄曲霉、黑曲霉的最低抑制浓度(MIC)为1.0%，对啤酒酵母的最低抑制浓度(MIC)超过了1.0%[16]。

3 结论

以新鲜的香蕉皮为原料，通过超声波-微波辅助方法提取香蕉皮中的抑菌物质，主要分析了乙醇溶液浓度、液固比、超声波温度、超声波时间以及超声波功率等五个单因素对香蕉皮提取物抑菌效果的影响。实验结果显示：乙醇浓度为80%，液固比为101，超声波时间20 min，超声波功率120 W，超声波温度30 ℃时，抑菌圈直径的平均值达到最大，为9.28 mm。

本实验提取的是多种成分的混合物，混合物间的相互作用以及抑菌物质的有效浓度都会影响最终的实验结果；此外，实验过程中，以抑菌圈为指标评价提取物的抑菌效果，并不能表明从香蕉皮中提取抑菌物质含量的多少，后续的研究应对目的抑菌物质进行纯化并选择不同的菌群同时测定抑菌性能。