基于网络药理学与分子对接技术的催汤颗粒治疗新冠肺炎研究

陈旅翼，刘鹏，王静，刘新桥，陆少娟，陈维武

(1 中南民族大学 药学院，武汉 430074；2 西藏奇正藏药股份有限公司，林芝 860000)

2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的急性肺炎简称“新冠肺炎”，该病毒经飞沫、接触等途径传播. 研究表明，3CL水解酶是SARS-CoV-2的一个关键蛋白质，病毒需要利用它来复制RNA[1]；ACE2受体蛋白是SARS-CoV-2感染细胞必需蛋白[2].

《四部医典》、《甘露宝瓶》等藏医学经典古籍对呼吸道传染病或疫病的防治都有详细阐述，其中《四部医典》称为“年仍奈”. 新冠肺炎属藏医“年仍奈”范畴，具有疫毒性质.进行辨证论治，防治强调“热症催熟与祛邪”相结合. 本次疫情中，西藏自治区、青海省卫生健康委员会依据《四部医典》及其他古籍文献中关于防治瘟疫的记载，提出了防治新冠肺炎的经典验方，其中就包括催汤颗粒[3-5]. 催汤，藏语音译，又译为“赤汤”，是藏医防治感冒、流感的传统汤剂. 催汤颗粒是在已上市药品催汤丸的基础上改变剂型而得[6-8]. 2003年非典流行期间，催汤颗粒(丸)曾被推荐在西藏等地防治使用.催汤丸现被收录于《中国药典》2010年版一部.在防治新型冠状病毒感染的肺炎疫情中，催汤颗粒被列入“甘肃方剂”，并通过应急审批用于防疫一线[9-10].

催汤颗粒是在四味藏木香汤[藏木香、悬钩子茎(去皮、心)、宽筋藤(去皮)、干姜]的基础上加藏木香膏和三果汤[诃子肉、余甘子、毛诃子(去核)]、螃蟹甲组成. 方中藏木香和藏木香膏清热凉血，调龙；干姜调气、解郁止痛，除瘀血；宽筋藤清热解毒，悬钩子茎清热凉血、解毒消肿；四药共用可以将未成熟热分离开来，促进未成熟热成熟，解表发汗或将扩散的病邪收拢后排出体外；诃子调和人体功能，敛肺下气、止咳，毛诃子清热、敛黄水，余甘子清热凉血，三药并用调和三因，调和诸药. 《四部医典》记载三果(诃子、余甘子、毛诃子)“主治瘟疫、紊乱热症、促使热症成型”[11]. 螃蟹甲清热祛风，解表，润喉. 全方具有清热解表、发汗、镇咳止痛、化痰等作用. 用于感冒初期，咳嗽头痛，关节酸痛，预防流行感冒等[12]. 本研究在网络药理学分析的基础上[13]获得催汤颗粒的核心活性化合物，对SARS-CoV-2 3CL水解酶(3CLpro)和ACE2 进行分子对接[14]，预测催汤颗粒抗新冠病毒作用，从而为该方防治新冠肺炎的机制研究与临床应用提供参考.

1 材料

TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)；化学专业数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/default.htm)；Swiss Target Prediction数据库(http://www. swisstargetprediction.ch/)；STRING数据库(https://string-db.org/)；Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/)；Enrichr数据库(https://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/)；OmicShare平台(http://www.omicshare.com/tools)；PDB数据库(https://www.rcsb.org/)；Cytoscape 3.7.2软件；Venny 2.1.0在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)；Sybyl 1.0软件(美国Tripos公司)；Discovery Studio 2017 R2 Client(DS，美国Accelrys公司开发，https://www.3dsbiovia.com/).

2 方法

2.1 获取催汤颗粒的成分

以土木香、余甘子、宽筋藤、悬钩子、干姜、诃子、毛诃子和螃蟹甲为关键词，从TCMSP和化学专业数据库纳入符合口服生物利用度(OB)≥30%及类药性(DL)≥0.18 的化合物，构建催汤颗粒化学成分数据库.

2.2 获取和预测成分靶点

PubChem数据库获取化学成分的分子结构，保存为sdf文件格式，导入Swiss Target Prediction，设置属性为“homo sapiens”，得到化合物的作用靶点，整合、去重后得到靶点.

2.3 获取疾病靶点

以“coronavirus”为关键词，在GeneCards数据库检索.

2.4 绘制韦恩图，获取潜在作用靶点

在Venny2.1.0平台上分别录入催汤颗粒和冠状病毒的靶点，得到两者的交集，作为潜在作用靶点.

2.5 网络模型的构建及分析

将药物活性成分以及2.4项获得的潜在作用靶点分别导入Cytoscape软件，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络图，药物、成分、靶点和疾病分别用不同的颜色表示. 使用Network不着Analyzer功能对药物中的主要活性成分进行分析，节点的大小代表度(degree)值的大小.

2.6 构建蛋白相互作用(PPI)网络

将催汤颗粒治疗冠状病毒的潜在作用靶点输入STRING数据库，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，获取蛋白相互作用信息. 将结果导入Cytoscape软件，绘制PPI图. 其中，节点的大小和颜色的深浅变化代表度值的大小，并根据节点的度值筛选出核心靶点.

2.7 通路富集分析

选取活性成分的核心靶点，利用Enrichr 网络平台中GO(gene ontology)和KEGG 通路，以OmicShare平台构建核心靶点的GO 生物过程、细胞分析、分子功能和KEGG 通路气泡图，分析催汤颗粒抗冠状病毒的生物过程和信号通路.

2.8 活性成分与病毒及ACE2分子对接结果

从PubChem数据库中下载相应化合物结构式(SDF格式)，Sybyl软件对其进行能量优化，保存为mol2格式，作为小分子配体.从PDB数据库下载SARS-CoV-2冠状病毒3CL水解酶(PDB ID：6LU7)和血管紧张素转化酶 II(ACE2，PDB ID：1R4L)的晶体结构，运用 Sybyl 软件对靶蛋白进行修饰、加氢及加电荷，将处理后的蛋白保存，作为受体. 利用sybyl1.0软件Surflex-dock 模块将小分子配体与受体进行分子对接，对接的结果以打分函数Total Score 给出，以mol2格式保存. 采用Discovery Studio软件中receptor-Ligand Interactions模块对分子对接结果进行分析.

3 结果

3.1 催汤颗粒的潜在活性成分

通过对催汤颗粒中每味药材成分进行OB和DL筛选，去重后，获得化合物120个，具体数据见表1.

表1 藏药-成分-靶点基本信息统计Tab.1 Basic information statistics of Tibetan medicine-component-target

3.2 潜在靶点预测

Swiss数据库中得到的预测靶点去除重复后，得到药物靶点479个(表1). 通过GeneCards数据库得到疾病靶点291个，两者取交集后获得共同靶点60个. 结果显示，催汤颗粒可能通过多靶点协同发挥抗冠状病毒作用.

图1 催汤颗粒与冠状病毒靶点韦恩图Fig.1 Venny diagram of Cuitang granules and coronavirus target

3.3 药物-成分-靶点-疾病网络构建

经分析，60个交叉靶点与催汤颗粒中的75个化合物有关联(表2). 图2 度值表示预测出该成分与作用靶点的关联个数，度值越大越说明该成分越重要. 对网络图通过Network Analyzer分析，结果显示在75个与潜在靶点相互作用的活性成分中，6个成分均能与10以上的靶点相连.

表2 交叉靶点的藏药-成分-靶点基本信息统计Tab.2 Cross-target Tibetan medicine-component-target basic information statistics

3.4 PPI网络构建结果

60个药物-疾病共同靶点录入STRING数据库中，得到PPI网络关系数据，构建PPI网络图(图3)节点度的中位数为15.5. 在60个核心靶点中，GAPDH、IL6、TNF、MAPK1、MAPK3、EGFR、MAPK8、CASP3、IL2、ICAM1、JAK1、STAT1、MAPK14、BCL2L1、FGF2、PTGS2、CASP8、LCK、NOS3、PPARG、HMOX1、MCL1、STAT6、PIK3CA、HPGDS、NOS2、PARP1、SERPINE1、HSPA5、PIK3R1这30个靶点的连接度均大于等于中位数15.5. PTGS2、EGFR、PARP1、TTR、PTGS1、PIK3R1、PPARG、NOS2、PIK3CG均可作用于10个以上的成分.

图2 催汤颗粒的藏药-成分-靶点-疾病网络Fig. 2 Tibetan medicine-component-target-disease network of Cuitang granules图中绿色圆圈节点代表基因，紫色菱形节点代表化合物，蓝色四方形节点代表藏药

图3 PPI网络构建Fig.3 PPI network construction

3.5 靶点通路分析

将60个潜在靶点经Enrichr 网络平台中GO富集分析，得到1390个生物学过程(P<0.05)、82个细胞组分、186个分子功能. 以P<0.01为阈值，以Count值排序，分别筛选前20条GO条目，绘制气泡图(图4). 60个潜在靶点经Enrichr 网络平台中KEGG分析(P<0.05)，共富集于209条信号通路(图4(d))，主要涉及HIF-1信号通路、病毒感染通路、TNF信号通路、VEGF信号通路和凋亡相关通路等.

(a) GO生物过程 (b) GO细胞分析

3.6 催汤颗粒核心成分的分子对接验证

将3.3中筛选得到的75个化合物分别与 SARS-CoV-2 冠状病毒3CL 水解酶和 ACE2 靶标蛋白进行分子对接，Total Score值>4.25说明化合物与靶点具有一定结合活性，筛选得到42个化合物，结果见表3和图5. 催汤颗粒中有6个化合物与SARS-CoV-2 冠状病毒3CL 水解酶的对接得分>5.0，有25个化合物与ACE2的对接得分>5.0，其中beta-谷甾醇、Phyllanthin、Acanthoside B、反油酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷等分别对3CL水解酶和 ACE2 具有很好的结合活性，总得分值超过12，说明催汤颗粒中的多个化合物能与 3CL 水解酶及ACE2 有较好的结合活性，显示催汤颗粒抗新冠病毒的潜在作用及其特点.

表3 催汤颗粒核心成分的分子对接验证Tab.3 Molecular docking verification of the core components of Cuitang granules

Beta-谷甾醇-SARS-CoV-2 3CL 水解酶 Phyllanthin -ACE2 图5 催汤颗粒核心化合物与 SARS-CoV-2 3CL 水解酶和 ACE2 的结合模式图Fig.5 Diagram of the binding pattern of Cuitang granules′ core compounds to SARS-CoV-2 3CL hydrolase and ACE2

4 结语

本研究以“coronavirus”为关键词进行检索，涉及479个核心靶点，与冠状病毒疾病靶点(351个)交叉60个. 将60个潜在靶点做GO富集分析，得到1390个生物学过程、82个细胞组分、186个分子功能，共富集于209条信号通路. 生物过程主要涉及细胞因子介导、细胞因子调节、细胞因子刺激和细胞凋亡等. 在细胞组分中，靶点主要涉及细胞器腔、线粒体和质膜、溶酶体；在分子功能中，主要涉及各类激酶活性、G蛋白偶联趋化因子受体活性、趋化因子结合和蛋白激酶结合；KEGG分析得到了与抗病毒相关的通路主要有HIF-1信号通路、病毒感染通路、TNF信号通路、VEGF信号通路等. 得到的60个关键靶点，大致分为炎症因子、丝裂原活化蛋白激酶和其他这3类.纵观催汤颗粒各化合物的作用、靶点的分类、富集的生物学过程和信号通路，较多地涉及病毒感染、炎症反应和免疫调节等方面.

COVID-19患者血清中IL-6等细胞因子的升高已经被证实[15]，因此催汤颗粒可能参与了IL-6的早期调节. 此外，催汤颗粒还能调节CASP3，NOS，TNF和ICAM1等炎症相关因子，能综合起到改善新冠肺炎的炎症风暴作用.

从KEGG分析结果可以看到，催汤颗粒抗病毒的途径广泛. 分子对接结果显示，有6个化合物与SARS-CoV-2冠状病毒3CL 水解酶有较好的结合活性，有25个化合物与ACE2有较好的结合活性，可以推测螃蟹甲、悬钩子、土木香、余甘子可能在催汤颗粒发挥潜在抗新冠肺炎作用中具有较大的贡献.