毛细管超速离心技术在体外预测大量胎母输血综合征的研究*

张源秦 王美茹 徐璐 马怡然 杨融辉 郝一文 程大也 丛桂敏

胎母输血综合征（fetomaternal hemorrhage，FMH）是指各种不同原因所致一定量的胎儿血液通过破损的胎盘屏障或绒毛间隙进入母体血液循环，引发一系列不同程度胎儿失血、贫血及新生儿溶血病和母体溶血性输血反应等临床症候群，也是非免疫性胎儿水肿的主要发病原因之一[1]。文献报道约93%孕产妇可能发生（失血量＜0.5 mL）胎母输血综合征，其中失血量＞30 mL的孕妇发生率为0.3%[2]。目前国内外尚无大量胎母输血综合征明确的诊断标准，ALMEIDA[3]认为胎儿出血量超过80 mL就会出现严重的胎儿贫血，即可定义为大量胎母输血。SAMADI[4]认为出血量超过100 mL，会发生胎儿死亡。还有作者认为胎儿向母体输送血液超过150 mL[5]，为大量胎母输血。围产儿死亡率达31%～50%，约13%的死亡与FMH相关，其中约5%的死胎是大量FMH造成的，多为FMH晚期的临床表现[6]。因此，大量胎母输血综合征的治疗关键在于早发现、早诊断、早监测。目前常用诊断胎FMH的方法有：流式细胞术、酸洗脱实验、HbF胎儿血红蛋白测定。为了诊断和定量胎儿出血量，酸洗脱实验（KB实验）是最常见的筛查方式，流式细胞术是胎母输血综合征的诊断金标准，但这两种方法需要配备专业的仪器和设备，价格昂贵且操作时间长需要专业人员操作，专业操作严格，尚未在临床广泛开展。因此，为了改善母婴妊娠结局，本研究通过体外模拟胎母输血综合征的血标本特点，将O型非妊娠全血输入非O型脐带血，运用毛细管分离技术检测胎儿红胞A或B抗原，旨在评估毛细管超速离心技术在ABO血型不一致的大量胎母输血的临床检测限及检出率，现报道如下。

材料与方法

1 标本来源 母体模拟血液标本：采集O型育龄期非妊娠期健康女性捐献者静脉全血2 mL，以EDTA-K2抗凝；胎儿模拟血液标本：A和B型新生儿脐带血，EDTA-K2抗凝。

2 试剂及仪器 抗A、B单克隆抗体（批号：20201216）为上海血液生物医药有限公司提供，HbF-GITC单克隆抗体（552829），为BD Biosciences公司；湘仪L550型离心机、Baso 2005-1型离心机、Diana配套孵育器及毛细管医用超速离心机等、生物显微镜（CX23LEDRFS1C）、ARIA2流式仪。

3 方法

3.1 胎母输血综合征模拟样本悬液的制备：取O型育龄期非妊娠健康女性捐献者EDTA-K2抗凝血2 mL分别与8.57 μL、11.4 μL、14.2 μL、17.14 μL、28.57 μL A或B型脐带血，按孕中后期孕妇血容量为7 000 mL（一般成人血容量在5 000 mL左右，孕中后期血液循环增加1～2 L[7]）发生了40、50、60、70、100 mL胎母输血综合的比例，同一个比例样本制备重复20次，室温下混合后孵育1小时期间并用震荡仪使其处在混匀状态。

3.2 胎母出血模拟样本悬液中胎儿细胞比例的检测：严格按照FITC-HbF单克隆抗体试剂说明书，以FITC标记的抗HbF抗体标记胎儿细胞，流式细胞术定量检测胎儿细胞百分比。实验同步以5%脐血的EDTA抗凝血分别加或不加单克隆抗体做阳性和阴性对照进行质量控制。

3.3 胎母出血模拟样本悬液用毛细管离心技术分离胎儿细胞：按2018版AABB技术手册[8]操作流程，将制备好模拟胎母输血综合征血样本用生理盐水洗涤三次，最后一次用1 000×g离心5 min，尽可能去掉上清后混匀。将洗涤后RBC吸出后混匀，加入1～2根比积管中，留出5 mm长度封口用。从血液加入端用橡皮泥封死管底，挤出的血液用纱布吸走。放入带有编号的离心槽，注意平衡，拧紧内盖，关上离心机外盖10 000 r/min离心15～20 min。在距红细胞柱顶（远心端）5 mm处切开微量红细胞比积管，此段红细胞主要为胎儿红细胞，见图6～8；在距红细胞柱底（近心端）5 mm处切开微量红细胞比积管，此段红细胞主要为母体新鲜红细胞。

3.4 试管法检测近心端、远心端红细胞ABO血型抗原：分别将近心端、远心端切开的红细胞比积管用生理盐水洗涤三次，按照《临床输血技术规范》[9]进行试管法红细胞ABO系统血型鉴定。近心端红细胞ABO血型鉴定结果为O型，远心端红细胞ABO血型鉴定结果与脐带血标本中的红细胞血型一致时证明毛细管超速离心技术分离成功。

4 统计学处理 采用prism8.0进行作图，运用诊断实验性指标进行诊断试验的分析与评价。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 胎母输血出血量达40 mL、50 mL、60 mL、100 mL时，流式细胞术结果如下图1，远心端模拟胎儿的A或B抗原的镜下凝集图如图2。

图1 模拟不同FMH出血量对应的流式图

图2 模拟FMH毛细血管离心后远心端A（B）试管法镜下凝集

2 当胎母输血量达到60 mL时，灵敏度为0.8，特异度为0.95，符合率为0.875，约登指数为0.75最接近1，诊断价值较大。见表1。

3 ROC曲线下面积诊断价值判断 当模拟胎母输血为50 mL、60 mL、100 mL时，ROC曲线下面积分别为0.725、0.875、0.850，均P＜0.05，差异具有统计学意义，此时用毛细管离心技术诊断胎母输血综合征具有诊断价值。见表2、图3。

图3 毛细血管离心技术诊断不同出血量FMH的ROC曲线分析

表2 ROC曲线下面积

4 临床病例运用 选取了两例临床高度怀疑发生FMH的O型产妇，用毛细管超速离心技术进行诊断，如图4。

图4 临床病例毛细血管离心技术分离后远心端结果

讨 论

胎母输血综合征可以发生在妊娠的各个时期，孕妇早期缺乏特异性临床表现、机体尚可代偿，一旦临床出现典型三联征表现（胎动减少或消失、胎心监护正弦波、胎儿水肿）提示胎儿出血已经非常严重。大量胎母输血综合征是一种罕见但有时候会危及生命的事件[10]。有研究报道胎儿在母体内短期发生大量出血可导致胎动频繁、血液大量流失，严重的可能发生胎儿出生后新生儿Apgar评分低、肌张力低、新生儿呼吸困难甚至窒息、胎死宫内等缺氧的临床表现[11,12]。

目前胎母输血综合征的诊断方式有流式细胞术、酸洗脱实验、胎儿血红蛋白HbF测定等。流式细胞术是诊断的金标准，但大多数医院缺乏相关大型检测设备，并缺乏专业技术人员操作；酸洗脱实验是目前最普遍的筛查方式，但假阳性和假阴性率高；胎儿HbF测定多用于科研，临床上均难以广泛开展。因此，想借用输血科异体红细胞分离的毛细管超速离心技术，该方法简便、易操作，不需要特殊试剂和复杂的操作，即可实验诊断大量胎母输血综合征。毛细管超速离心是根据受检者新旧输入红细胞的比重不同进行分层的一种实验技术[13]。毛细管直径小、长度大，在超速离心力作用下，有密度梯度区间能进行新旧细胞的分离。FMH孕妇自体新生的红细胞比重较小，集中在毛细管的近心端；通过破损胎盘反复输入母体的红细胞在老化过程中产生囊泡、膜逐渐丢失而比重不断加大，离心后集中在毛细管远心端[14]。

本研究通过模拟FMH发生出血的比例，在体外建立胎母输血综合征的模型，并尝试用毛细管超速离心技术进行分离胎母ABO血型不一致的胎儿红细胞。我们通过实验发现当胎儿出血量超过50 mL时，毛细管离心技术有较大的的诊断价值（ROC曲线下面积均＞0.725），其中胎母输血量为60 mL和100 mL时的约登指数均＞0.7，最接近于1，此时诊断价值最大。通过不同浓度梯度的FMH模拟实验发现：当胎母输血量越大时，特别是发生大量胎母输血（≥50 mL）时，毛细管超速离心技术对胎母输血综合征的筛查价值更大。通过20例阴性的对照试验发现，该诊断试验的特异度为0.95，即排除了亚型和疾病原因导致的抗原减弱等出现假阴性外，误诊率较低。因此，毛细管离心技术对于ABO血型不一致的大量FMH（≥50 mL）的初筛具有较高的灵敏度和特异度。此外，毛细管超速离心技术还有操作简便、费用低廉和创伤小等特点。

FMH诊断胎儿失血量目前国内外尚未有统一的标准，其临床的发生概率根据胎儿失血量的不同而不同。关于大量胎母输血综合征的定义从30 mL到150 mL不等，有学者将大量FMH的临界值定义为30 mL，对Rh阴性母亲在生育Rh阳性胎儿时预防性使用抗D免疫球蛋白的剂量有临床意义[15]。将出血阈值定义为80 mL和150 mL时，其FMH的发生率分别为1/1 000和1/5 000[3]。有文献报道5%的死胎是由于大量胎母输血造成的，通过孕期的主动监测、及时发现可疑的高危孕产可以改善围产期孕产妇的生命安全[6]。本实验研究的毛细管超速离心法识别胎母输血综合征的阈值为50 mL，可以识别出部分需要进行抗D免疫球蛋白预防的孕妇，可以识别出胎母输血阈值定义为80 mL以上的已发生胎母输血的孕妇，这就围产期预防RhD免疫、减少或预防胎儿及新生儿不良预后有一定的临床意义。

我们在实际临床工作中发现2例用毛细管超速离心技术诊断胎母输血综合征的病例。病例一：乔某，25岁，G2P0，O型RhD阳性，妊娠35+5周，妊娠合并慢性高血压，胎儿宫内窘迫，以“胎心监护异常1天”入院，完善相关检查后次日进行剖宫产手术分娩一2 750 g活婴，一分钟apar评分8分，5分钟10分。因胎儿胆红素超正常值2倍，新生儿溶血三项试验阳性，血型A型。病例二：孙某，30岁，G3P1，O型RhD阳性，丈夫血型为B型，妊娠30+4周，完全性前置胎盘，妊娠期糖尿病，先兆早产，因“自觉胎动减少，胎心监护异常2天” 入院。入院后期待疗法，密切进行胎心监护，待胎儿成熟后择期进行剖宫产。对这两例产妇的血进行毛细管离心技术，分别在案例一和案例二的远心端在反复离心后发现A细胞和B细胞镜下凝集。

综上所述，毛细管超速离心技术作为输血科异体红细胞分离的一种方法，在孕妇产前常规血型鉴定已知、排除ABO亚型及抗原表达异常的弱A弱B等情况下，若在妊娠中后期用毛细管分离发现母体存在大量ABO异型红细胞时，可以作为大量胎母输血综合征的一个监测指标。文献报道胎母出血量为30 mL的发病率为3/1 000[3]，但由于临床对其认识不足、检测方法受限，仍存在大量流产和胎死宫内的病例临床未报道，FMH实际发生率可能要高于这个比例。本文是利用毛细管超速离心技术筛选胎母输血征的实验研究，旨在摸索一个不需要昂贵设备及试剂的简单易行的可在临床常规开展的实验方法。我们在FMH的模型运用毛细管超速离心法，后期会继续收集高危孕妇病例标本进行检测。当然，本实验仅完成了以O型孕产妇通过毛细管超速分离技术检测出A或B红细胞来筛查胎母输血的情况。对于A型或B型孕妇与B型或A型胎儿之间的胎母输血的筛查敏感度和特异度有待于今后进一步实验验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突