三黄益肾胶囊防治糖尿病肾病实验研究

吕树泉 路菲菲 苏秀海 王元松

摘要 目的：比較三黄益肾胶囊与雷米普利胶囊对糖尿病肾病（DN）的干预作用，探析肾脏保护深层机制，为临床防治DN提供实验依据。方法：选用雄性SD大鼠，按随机数字表法分为空白对照组、模型对照组、雷米普利组、三黄益肾胶囊低剂量（0.4 g/kg）组、三黄益肾胶囊中剂量（0.8 g/kg）组、三黄益肾胶囊高剂量（1.6 g/kg）组6组，每组10只。给药治疗8周后，检测各组大鼠肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）及24 h尿微量白蛋白等指标。光镜下观察肾脏形态学变化。免疫组化观察肾病蛋白（nephrin）、单核细胞超化蛋白-1（MCP-1）、胰岛素样生长因子（IGF-1）蛋白表达，RT-PCR观察nephrin mRNA、MCP-1mRNA及IGF-1mRNA表达水平。结果：造模后大鼠TG、TC、SCr、BUN、24 h尿微量白蛋白、MCP-1及IGF-1mRNA水平均明显升高（P<0.05），nephrinmRNA表达明显降低（P<0.05）;与模型对照组比较，三黄益肾胶囊组TG、TC、SCr、BUN、24 h尿微量白蛋白、MCP-1及IGF-1 mRNA水平均明显下降（P<0.05），nephrinmRNA水平明显上升（P<0.05），并能改善大鼠肾组织病变。结论：三黄益肾胶囊可能通过下调IGF-1、MCP-1mRNA表达，上调nephrinmRNA表达，改善肾组织病变并起保护作用。

关键词 三黄益肾胶囊;糖尿病肾病;基因;蛋白;肾脏保护

Experimental Study on the Prevention and Treatment of Diabetic Nephropathy of Rats with Sanhuang Yishen Capsules

LYU Shuquan1，LU Feifei2，SU Xiuhai1，WANG Yuansong1

（1 Department of Endocrinology，Cangzhou Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital Affiliated to Hebei University of Traditional Chinese Medicine，Cangzhou 061001，China; 2 Graduate School of Hebei University of Traditional Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，China）

Abstract Objective：To compare the intervention effects of Sanhuang Yishen Capsules and Ramipril Capsule on rats with diabetic nephropathy，and to analyze the deep mechanism of renal protection，and to provide reliable experimental basis for clinical prevention and treatment of diabetic nephropathy.Methods：Male SD rats were selected and used and they were divided into 6 groups according to the random number table，namely a blank control group，a model control group，a ramipril group and the a Sanhuang Yishen Capsules low，medium and high doses（0.4，0.8，1.6）g/kg groups，with 10 rats in each group.After 8 weeks of drug administration，the indexes of creatinine，urea，triglyceride，total cholesterol and 24 h urinary protein were measured in each group.The morphological changes of the kidneys were observed under light microscope.The expression of nephrin，MCP-1 and IGF-1 protein expression were observed by immunohistochemistry.The expression of nephrin mRNA，MCP-1 mRNA and IGF-1 mRNA were observed by RT-PCR.Results：After modeling，the levels of triglyceride，total cholesterol，creatinineQ，urea，24-hour urinary microalbumin，MCP-1 and IGF-1 mRNA were significantly increased（P<0.05），and the expression of nephrin mRNA was significantly decreased（P<0.05）.Compared with the model control group，the levels of triglyceride，total cholesterol，creatinine，urea，24 h urinary microalbumin，MCP-1，and IGF-1 mRNA were significantly decreased in Sanhuang Yishen Capsules group（P<0.05），nephrin mRNA levels weresignificantly increased（P<0.05），and can improve renal tissue lesions in rats.Conclusion：Sanhuang Yishen Capsules may down-regulate the expression of IGF-1 and MCP-1 mRNA，up-regulate the expression of nephrin mRNA，improve the pathological changes of renal tissue and play a protective role.

Keywords Sanhuang Yishen Capsules; Diabetic nephropathy; Gene; Protein; Kidney protection

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.014

糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy，DN）是一种以持续性蛋白尿为特征的临床综合征，表现为肾小球滤过率进行性下降，血压升高，心血管发病率和死亡率增加，为糖尿病患微血管严重并发症之一[1]。据统计，20%～40%的1型糖尿病与2型糖尿病会发展为DN[2]，更以42.8%的高比例成为终末期肾病（ESRD）首要病因[3]。DN发病机制虽然研究较多但仍阐释不明，涉及遗传因素、糖脂代谢紊乱、炎性递质、细胞因子、生长因子等诸多方面，是综合作用的结果。单核细胞超化蛋白-1（MCP-1）、胰岛素样生长因子（IGF）等在DN发生、发展中的作用尚不明确。现代医学推崇以对症治疗为主，饮食调摄等为辅，严格限制蛋白摄入，控制血糖、血压，纠正脂代谢紊乱，进而改善肾脏微循环，但多治标不治本，同时ACEI类药物易引起干咳、升高血钾等，疗效不稳且不良反应大。而中医众多医家认为本病病因病机在于“气阴两虚，肾络瘀阻”，依此组方，辨证用药疗效显著[4]。本研究所用的三黄益肾胶囊由第六批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师苏秀海主任医师及河北省名中医王元松教授经验方转化而来，立论于早期肾病的病机为脾肾气阴两虚夹瘀血，治以“益气养阴，健脾补肾，活血通络”[5]，用之临床初显疗效，但与西药疗效的比较研究较少，深层机制待揭示。本研究采用链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）制备大鼠DN模型，采用RT-PCR检测三黄益肾胶囊对大鼠模型肾组织nephrin、MCP-1、IGF-1 mRNA表达的影响，从分子水平探讨其可能的作用机制，为中药治疗DN提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只，体质量210～230 g，中国医学科学院放射医学研究所提供，动物合格证号11401300065459，许可证号SYXK（津）2014-0002。自由饮水，适应性饲养1周，喂标准饮食，环境温度（20±2）℃，湿度40%～70%。12 h/12 h明暗昼夜交替（伦理审批号：2017091）。

1.1.2 药物 三黄益肾胶囊（由黄芪、西洋参、山药、山茱萸、菟丝子、黄精、地黄、芡实、金樱子、益母草、丹参、川芎、苍术、赤芍、王不留行组成），河北省沧州中西医结合医院制剂室制备，批号：Z20050795。按比例加入纯净水制成混悬液。雷米普利[赛诺菲（北京）制药有限公司，国药准字H20060766]。

1.1.3 试剂 链脲佐菌素（STZ）（Sigma公司，美国，货号：L-2880）。Trizol（Invitrogen，货号：15596-026）;氯仿（天津市永大化学试剂有限公司，货号：A14140）;异丙醇（天津市永大化学试剂有限公司，货号：1.01040.4008）;无水乙醇（天津市永大化学试剂有限公司，货号：10009218）;DEPC水（北京索莱宝科技有限公司，货号：RT121-02）;TIANScript RT KIT（天根生物科技有限公司，货号：KR107）;SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根生物科技有限公司，货号：FP205-01）。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型制备 健康SD大鼠60只，适应性饲养1周。1周后，按照随机数字表法选出10只作为正常组，剩余50只作为造模组。造模采用STZ诱导建立DN大鼠模型[6]，造模前禁食12 h，一次性腹腔注射STZ（65 mg/kg）。STZ用前使用枸橼酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH=4.5）配制，在10 min内用完;72 h后，尾静脉取血测血糖，连续3次，取平均值，血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，成功率约为70%，剔除未成模大鼠。

造模成功的大鼠按照随机数字表法分为模型组、雷米普利组、三黄益肾胶囊高观察组、三黄益肾胶囊中观察组、三黄益肾胶囊低观察组5组，每组10只，另10只作为正常组，共计6组。正常组与模型组以蒸馏水灌胃，1次/d。三黄益肾中剂量观察组（18 g溶于50 mL水中，2 mL/只/d）、高剂量观察组（24 g溶于50 mL水中，2.5 mL/只/d）、雷米普利组（2.5 mg/片）溶于50 mL水中，2 mL/只/d）。4组均1次/d，连续8周。实验期间未使用胰岛素和其他降糖药物。

1.2.2 樣品制备 所有大鼠模型给药8周后，以颈静脉采血后处死。所采血液放置于离心机，3 000 r/min高速离心15 min，取上清液，置于-80 ℃备用。取大鼠双侧肾脏，滤纸清洁表面血渍，另取部分肾脏组织放置于4%多聚甲醛液中固定，其余剩余肾脏组织则-80 ℃保存备用。

1.2.3 苏木素刊尹红（HE）染色 取肾脏组织进行常规的石蜡包埋，切片，石蜡切片厚度为4 μm，进行HE染色，显色后显微镜下观察组织病理变化。

1.2.4 免疫组化法检测 采用免疫组化法检测肾组织中nephrin、单核细胞超化蛋白-1（MCP-1）、胰岛素样生长因子（IGF）表达，石蜡切片常规脱蜡至水，抗原修复，加一抗1∶100兔抗鼠nephrin、MCP-1、IGF-1，4 ℃过夜。二抗选用1∶400稀释山羊抗兔抗体，严格按照nephrin、MCP-1、IGF-1试剂盒说明操作，计算nephrin、MCP-1、IGF-1蛋白表达相对含量。

1.2.5 RT-PCR 采用Trizol提取组织样本中总RNA，步骤如下：1）用研钵研磨组织样品，于加有1 mL Trizol的离心管中，静置5～10 min;2）加入0.2 mL氯仿上下剧烈混匀15～30 s，然后静置3 min（冰浴或室温）;3）4 ℃，12 000 r/min，离心15 min，离心半径13.5 cm;4）取水相到新的EP管中，加入0.5 mL异丙醇，混匀，冰浴10 min;5）4 ℃，12 000 r/min，离心10 min，离心半径13.5 cm;6）倾倒上层液体，用75%冰乙醇沉淀（1 mL），混匀;7）4 ℃，12 000 r/min，离心5 min，离心半径13.5 cm;8）干燥。加入DEPC处理水溶解RNA，测浓度，-80 ℃保存。后取5 μLRNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。

再用TIANScript RT KIT进行反转录，实验操作按产品说明书进行，用RNase-Free ddH2O将反应体系稀释到50 μL，-20 ℃保存。最后用荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据相对定量分析，计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品目的基因mRNA转录水平的差异。

1.3 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用方差分析，自身前后对照比较应用配对t检验;计数资料比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠治疗后24 h尿微量白蛋白定量比较与正常组比较，模型组、雷米普利组、三黄益肾胶囊各剂量组24 h尿微量白蛋白定量均明显升高（均P<0.05）;与模型组比较，西药组及三黄益肾胶囊各剂量组24 h尿微量白蛋白定量均明显降低（均P<0.05），其中三黄益肾胶囊高剂量组的24 h尿微量白蛋白定量降低最为显著（P<0.05）。见表1。

2.2 各组大鼠治疗后BUN、SCr、TG及TC水平比较与正常组比较，模型组SCr、BUN、TG、TC等水平明显升高，2组比较差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，雷米普利组、三黄益肾胶囊低剂量组、三黄益肾胶囊中剂量组及三黄益肾胶囊高剂量组的TG、TC、SCr、BUN明显降低（P<0.05）;与雷米普利组比较，三黄益肾胶囊低、中、高剂量组TG、TC、SCr、BUN明显降低（P<0.05）。

2.3 各组大鼠治疗后nephrin mRNA、MCP-1mRNA、IGF-1mRNA表达水平比较 与正常组比较，模型组IGF-1mRNA及MCP-1mRNA表达显著升高（P<0.05），而nephrin mRNA表达显著降低，2组比较，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组比较，雷米普利组及三黄益肾胶囊高、中、低组IGF-1mRNA及MCP-1mRNA表达均降低（P<0.05），而nephrinmRNA表达升高，组间比较，差异均有统计学意义（P<0.05），其中三黄益肾胶囊高剂量组疗效更佳（P<0.05）。见表3。

2.4 各组大鼠治療后nephrin、MCP-1、IGF-1蛋白表达比较 与正常组比较，模型组IGF-1及MCP-1蛋白表达显著升高（P<0.05），而nephrin蛋白表达显著降低（P<0.05）;与模型组比较，三黄益肾胶囊高、中、低剂量组IGF-1及MCP-1蛋白表达均降低明显（P<0.05），而nephrin蛋白表达升高，有统计学意义（P<0.05），其中三黄益肾胶囊高剂量组疗效更佳（P<0.05）。见图1。

2.5 三黄益肾胶囊不同剂量对大鼠肾组织病理改变的影响 HE染色可见：空白组大鼠肾脏组织结构大致正常;模型组大鼠肾小球体积增大，基底膜增厚，系膜基质增生，部分肾小管上皮显示空泡样变性，间质区有炎性细胞浸润。各观察组大鼠肾脏组织病理损伤，均较模型组大鼠有不同程度的减轻，其中以三黄益肾胶囊中剂量组、三黄益肾胶囊高剂量组、雷米普利组大鼠损伤减轻更为明显。见图2。

3 讨论

DN科归于中医学“虚劳”“肾劳”“水肿”“肾消”“关格”“尿浊”之列，属于消渴并发水肿范畴[7]。现代医学认为糖尿病属于内分泌代谢常见病，患者常伴眼、肾、血管、神经等组织器官病变等多种慢性并发症，以持续性蛋白尿，顽固难愈为显著临床特点。常通过控制血糖、血压、血脂等治疗，同时采用维生素或矿物质进行补充治疗[8]。主要依赖药物是ACEI或ARB降压药、蛋白激酶C抑制剂或罗格列酮等PPAR-γ激动剂等，虽短期降糖作用明显，但治疗方法单一且不良反应较大，危重病患疗效不显著[9]。

近些年诸多研究显示：DN的发生、发展与糖代谢紊乱及肾脏血流动力学改变存在密切关系，同时与多种细胞因子的异常表达、遗传基因易感性、氧化应激等因素存在相关性[10]。本研究中，我们设置三黄益肾胶囊高、中、低剂量组，同时比较临床常用西药雷米普利[11]，结果显示三黄益肾胶囊对于DN大鼠的异常指标调节作用强于雷米普利，表现出优于西药的治疗效果，与既往实验结果相吻合[12]。三黄益肾胶囊由黄芪、当归、芡实、生地黄等组成。临床研究发现益肾胶囊可明显降低24 h尿微量白蛋白含量，改善DN患者临床症状[13-14]，近期研究也提出联合用药，比如联合胰激肽原酶肠溶片治疗DN效果更好[15]。但是其中机制如何，一直未研究清楚。

研究表明：刘秀丽等[16]研究认为三黄益肾胶囊通过下调肿瘤坏死因子（TNF-α）表达，上调肾脏基质金属蛋白酶（MMP-9）表达而延缓糖尿病大鼠的肾脏损害。另有研究也提出三黄益肾胶囊可能通过升高DN大鼠肾组织匀浆NO及NOS含量而发挥肾脏保护作用[17]。迟秀娥等既往研究提示三黄益肾胶囊可通过抑制转化生长因子β1（TGF-β1）和血管内皮生长因子（VEGF）在肾脏的表达延缓糖尿病大鼠的肾损伤[12]。但三黄益肾胶囊具体通过何种机制治疗DN尚存在争议。本研究中，我们聚焦nephrin、MCP-1、IGF-1等关键位置的基因与蛋白表达水平，试图探索其可能的DN大鼠肾脏保护机制。一方面，DN患者蛋白尿的产生与裂孔隔膜关系密切，裂孔隔膜是连接相邻足细胞足突间的特殊蛋白复合体，nephrin是其上重要跨膜蛋白，异常表达会造成过膜形态结构和屏障功能障碍。本研究中，模型大鼠给药三黄益肾胶囊后，nephrin基因及蛋白表达升高。另一方面，单核细胞/巨噬细胞在肾组织的广泛浸润与DN有关，MCP-1是其特异性的趋化因子，具有单核巨噬细胞特异性趋化激活作用，对其具有很强的趋化作用，可促进炎性反应的发生。Banba等[18]认为DM患者的系膜细胞产生的MCP-1在对单核巨噬细胞的浸润及激活中起了重要作用，并且导致和加重了DN。本研究中，模型大鼠给药三黄益肾胶囊后，MCP-1水平降低，从而抑制肾脏表达多种因子，降低血管通透性，改善蛋白尿[19]。另外，IGF-1作为多肽类神经营养因子，具备广泛生物学活性，能够调节细胞、组织生长，促进骨骼生长和细胞的分化成熟等。其结构和功能类似于胰岛素，能发挥胰岛素样作用，提高机体胰岛素敏感性，影响外周组织对葡萄糖的摄取来维持正常血糖[20]。许多研究表明：IGF-1不但可有效地改善糖代谢，还可改善脂代谢[21]。IGF-1会伴随DN大鼠血糖升高而升高，且当肾小球位于高糖环境中时，IGF-1以自分泌方式在肾脏中合成增加。本试验提示三黄益肾胶囊可能通过降低血糖、改善肾小球微循环下调IGF-1含量，达到保护肾脏的作用。

早期研究表明：DN早期患者的肾小球滤过率增加与肾微血管增殖是一种可逆的病理变化，故抑制肾微血管病理变化对于健康恢复至关重要[22]。张戟风等光镜下观察肾组织病理学改变后发现：DN模型大鼠的肾组织表现为肾小球内皮细胞肿胀、系膜细胞增多，肾小管上皮肿胀，部分坏死且肾间质有炎性细胞浸润。但三黄益肾胶囊可起到肾组织改善作用[23]。故在本研究中，我们通过成功建造DN大鼠模型，取样并进行HE染色，发现：模型组大鼠肾脏组织细胞出现增生，排列混乱且肾小球内细胞减少。进行干预后，取样所得大鼠肾脏组织细胞排列整齐，肾小球内细胞无明显变化，进而从细胞形态层面证实了三黄益肾胶囊对肾细胞的修复作用。

总之，本研究通过实验观察到三黄益肾胶囊对nephrin、MCP-1、IGF-1基因及蛋白表达的影响和DN大鼠肾脏给药前后的形态变化，证实了三黄益肾胶囊对DN大鼠的肾脏保护作用，同时推测三黄益肾胶囊可能通过上调nephrin及下调MCP-1、IGF-1基因及蛋白表达以减少蛋白尿，保护肾脏。

致谢：本实验研究的顺利进行，感谢河北省王元松名中医传承工作室的资金赞助及科研相关支持。

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（2019-08-05收稿 责任编辑：芮莉莉）