基于“寒凝血瘀“关键病机理论探讨新加良附方治疗胃癌的网络药理学研究

国佳鑫 侯丽 蔡和平 栗枭杰 杨茜茹 张思亲 董青

摘要 目的：通過网络药理学方法探讨新加良附方治疗胃癌的作用机制。方法：在中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）中获取高良姜、香附、穿山龙的有效成分及靶蛋白，通过Genecards、OMIM数据库筛选出胃癌的靶点，利用Venn软件获取共同靶点，使用Cytoscape3.7.2进行“化合物-靶点-疾病”的网络图构建。通过String数据库获取蛋白互作网络（PPI），最后进行GO功能、KEGG通路富集分析。结果：从新加良附方中筛选出高良姜素、槲皮素、木犀草素、薯蓣皂苷元等主要有效活性成分，作用于87个胃癌靶点，筛选出AKT1、MYC、CASP3、EGFR等关键靶点，并确定了PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Wnt信号通路等关键代谢信号通路，参与蛋白结合、转录因子活性、酶活性调节、受体活性等过程。结论：新加良附方通过多个靶点、多条通路发挥治疗胃癌的作用。

关键词 新加良附方;寒凝血瘀;高良姜;香附;穿山龙;胃癌;网络药理学;作用机制

Based on the Key Pathogenesis Theory of “Cold Coagulation and Blood Stasis” Discussing the Network Pharmacology Study of Modified Liang-Fu Formula In The Treatment of Gastric Cancer

GUO Jiaxin1，HOU Li1，CAI Heping2，LI Xiaojie1，YANG Qianru1，ZHANG Siqin3，DONG Qing1

（1 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100020，China; 2 Beijing Traditional Chinese Medicine Hospital Shunyi Hospital，Beijing 101399，China; 3 Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）

Abstract Objective：To explore the mechanism of action of modified Liang-Fu Formula in the treatment of gastric cancer through network pharmacology method.Methods：The effective components and target proteins of Alpinia officinarum Hance，Cyperus rotundus L and Discorea nipponica Makino were from the traditional Chinese medicine system pharmacology analysis platform （TCMSP）.And the target of gastric cancer was gotten through the Genecards and OMIM database.Venn online software was used to obtain the common target，and the “compound-target-disease” network diagram was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software.The String database was used to draw the protein interaction（PPI） network.Finally，enrichment analysis of GO function and KEGG pathway was carried out.Results：The main active components，such as galangin，quercetin，luteolin and diosgenin，were screened out from the negaeliang side，and acted on 87 gastric cancer targets.Key targets，such as AKT1，MYC，CASP3 and EGFR，were screened out，and key metabolic signaling pathways，such as pi3K-Akt signaling pathway，p53 signaling pathway，and Wnt signaling pathway，were determined.It was involved in protein binding，transcription factor activity，enzyme activity regulation，receptor activity and other processes.Conclusion：Modified Liangfu Formula plays a role in the treatment of gastric cancer through multiple targets and pathways.

Keywords Modified Liang-Fu Formula; Cold coagulation and blood stasis; Alpinia officinarum Hance; Cyperus rotundus L; Discorea nipponica Makino; Gastric cancer; network pharmacology; Mechanism of action

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.004

在世界范围内，亚洲为胃癌发病率最高的地区。据统计，2015年中国恶性肿瘤新发病例42.92万例，死亡病例28.14万例，而胃癌的发病率和病死率分别为679.1/10万和498/10万[1]。尽管近年来胃癌的发病率及病死率均有所下降，但胃癌患者的治疗及其由此产生的不良反应仍是困扰医学界的一大难题。中医药在改善胃癌患者症状、延迟生存期方面具有独特的优势，有待进一步研究。

网络药理学是通过对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子分析的新方法[2]。体现了中药复方“多成分、多靶点、多途径”的治疗特点，符合中医药对疾病本质的认识。新加良附方由《良方集腋》中的良附丸加味化裁而来，主要用于寒凝血瘀证。本研究基于寒凝血瘀关键病机理论，以新加良附方为切入点，用网络药理学分析方法探讨其治疗胃癌的作用机制，以期为临床提供新的治疗思路。

1 资料与方法

1.1 胃癌相关靶点的获取

以“Gastric Cancer”为关键词，在GeenCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//omim.org/）2个疾病数据库中检索，获取胃癌相关靶点。

1.2 药物活性成分以及对应靶点的获取

应用中药系统药理学数据与分析平台（http：//tcmspw.com/tc-msp.php），分别检索新加良附方中3种药物高良姜、香附、穿山龙的有效成分，时间截止在2019年9月13日，通过类药性指数（DL）和口服生物利用度（OB）进行设定限制条件，筛选阈值设定为OB>30%且DL>0.18，并通过筛选结果在此平台获得有效成分的蛋白作用靶点。

1.3 构建药物有效成分-靶点和胃癌疾病-靶点网络的可视图

用Veen软件获取药物作用靶点与疾病作用靶点的交集，以获得药物与疾病潜在靶点的相互作用，然后运用Cytoscape3.7.2软件构建药物有效成分-靶点和胃癌疾病-靶点网络的可视图。

1.4 新加良附方治疗胃癌靶点蛋白互相作用网络（PPI）的构建

将获取的药物-靶点共同作用蛋白上传到在线String数据库（https：//string-db.org/），设置“Homo Sapiens（人类）”进行操作，构建蛋白质相互作用网络模型，获得PPI网络图。

1.5 GO功能富集分析与KEGG通路富集分析

将药物有效作用靶点上传到David6.8数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），进行GO功能富集分析与KEGG通路富集分析，获取核心部分的生物学过程及信号通路，探索新加良附方治疗胃癌可能的作用机制。

2 结果

2.1 胃癌疾病靶点的筛选

通过检索GeenCards数据库共得到与胃癌相关靶点11 353个，以Relevance score>23为筛选条件，筛选后共获取510个相关靶点，在OMIM数据库中共检索到490个相关靶点，通过筛选重复值后，共获得929个相关靶点。

2.2 药物活性成分及作用靶点

通过TCMSP的检索及OB>30%且DL>0.18的条件筛选后，获得高良姜的有效成分13种，香附的有效成分18种，穿山龙的有效成分3种。见表1。在有效成分检索中，获得194个药物作用靶点。

2.3 构建药物有效成分-靶点和胃癌疾病-靶点网络的可视图

将检索得到的194个药物作用靶点和929个胃癌相关靶点通过Uniprot数据库进行标准化处理，然后通过Veen软件得到疾病相关靶点和药物作用靶点的交集，共获得87个共同靶点。见图1。通过Cytoscape3.7.2软件构建药物活性成分-靶点和胃癌疾病-靶点的可视化网络图。见图2，表2。

2.4 药物治疗胃癌的PPI网络图

将药物与疾病共同的87个靶点上传至String数据库，设置置信度大于0.4，获得PPI网络。见图3。共获得87个关键靶点蛋白，1 624条相互作用蛋白之间相互作用的边线，根据count值筛选出药物治疗胃癌的前30个关键靶点蛋白。见图4。

2.5 药物治疗胃癌的功能富集分析与通路富集分析

2.5.1 GO功能富集分析

将药物与疾病相关的87个靶点导入David平台进行GO功能富集分析，以P<0.01为筛选条件，筛选出GO条目共92个，其中主要涉及受体活性、蛋白结合、酶活性调节、转录因子活性等方面，根据其生物学功能排名获取前20的条目。见图5。包括泛素样蛋白连接酶结合、泛素蛋白连接酶结合、激酶调节活动、细胞因子受体结合、DNA结合轉录激活剂活性，RNA聚合酶Ⅱ特异性、细胞因子活性、活化转录因子结合、蛋白激酶调节活性、磷酸酶绑定、蛋白磷酸酶绑定、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、核受体的活动、转录因子活性，直接配体调控序列特异性DNA结合、整合素结合、受体配体活动、激酶活化剂活动、生长因子受体结合等。

2.5.2 KEGG通路富集分析

将87个靶点导入David平台进行KEGG通路富集分析，共确定了149条富集通路，涉及癌症、炎性反应、感染等各方面。排名靠前的通路主要包括膀胱癌、乙型肝炎、前列腺癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、胰腺癌、IL-17信号通路、人类巨细胞病毒感染、糖尿病并发症信号通路、丙型肝炎、流体剪切应力和动脉粥样硬化、结肠直肠癌、肝细胞癌、EB病毒感染、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药、非小细胞肺癌、细胞衰老等。通路富集结果涵盖了以下几个重要通路：PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Wnt信号通路等。

3 讨论

在中医学中，胃癌归属于“噎膈”“反胃”“癥瘕”“胃积”等范畴，其发病与饮食、情志、正气不足等多方面因素有关[3]，其关键病机为寒凝血瘀[4]，中医治疗以温阳散寒化痰为主要原则。此方以温中散寒、理气化痰、活血止痛为主要功效，主要用于寒凝血瘀证，高良姜温胃止呕、散寒止痛;香附疏肝解郁、理气宽中、调经止痛;二药疏气散寒;穿山龙祛风除湿、活血止痛、止咳平喘，可融于良附丸之中活血祛瘀，制约高良姜之辛热，防止香附之辛散。三药合用，奏温中散寒、理气化痰、活血化瘀之效，是针对“脾阳不振、内外寒邪交织”导致“寒凝血瘀、气机阻滞、集结胃腑”所致的胃癌的治疗良剂。现代研究表明，新加良附方可能通过逆转胃癌细胞中p16甲基化这一效应机制来发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用，而且此方的临床疗效与剂量成正比的关系[5]。还有研究发现，新加良附方可以通过调节Bcl-2与Akt的表达进而抑制人胃癌BGC-823细胞的增殖[6]，通过调节肿瘤细胞中Caspase-3、Fas、Survivin、FasL蛋白的表达来诱导胃癌细胞进行凋亡[7-9]。以上研究成果均表明新加良附方在抑制胃癌细胞增殖、促进其凋亡等方面具有良好的作用。

3.1 药物有效成分

本次研究结果显示，高良姜的有效活性成分主要包括高良姜素、槲皮素、美迪紫檀素、谷甾醇等，现代药理学研究表明其有效成分在抗肿瘤细胞增殖、抗氧化、抗炎性反应和镇痛等方面具有较明显的效果[10]。香附的有效成分主要包括山柰酚、豆甾醇、木犀草素、槲皮素等，现代药理学研究表明其有效成分具有抑制肿瘤细胞增殖、抑制血小板聚集、解热镇痛抗炎等作用[11-13]。穿山龙的有效活性成分主要包括薯蓣皂苷元、表紫杉醇、土茯苓素等，现代药理学研究表明其在抗肿瘤、调节免疫、抗炎等方面具有较明显的作用[14]。

根据研究中的“有效成分-靶点-疾病”可视化网络图可见高良姜素、槲皮素、木犀草素、薯蓣皂苷元等有效成分作用靶点较多，且度值和介数较高，提示这些有效成分是治疗胃癌的关键有效成分。高良姜素是一种天然的黄酮类化合物，贺文煜等[15]通过体外细胞培养实验得出结论，高良姜素与阿帕替尼联合使用可能通过2个通路对胃癌细胞起到抑制其增殖、诱导其凋亡的作用，这2个通路分别是PI3K/Akt通路和p38-MAPK通路;同时国外有研究表明，高良姜素单药可以抑制胃癌细胞的增殖[16]。Bestwick等[17]通过实验得出高良姜素可能通过影响caspase-3的表达增强对胃癌细胞抑制增殖的作用。许云霞等[18]通过噻唑蓝法对细胞进行实验得出，高良姜素可能通过线粒体途径抑制胃癌细胞增殖并促进其凋亡。另有研究表明，高良姜素具有明显抑制胃癌活性的作用，可能与抑制STAT3介导的细胞凋亡与周期通路的作用机制有关系[19]。

槲皮素是一种黄酮类化合物，是高良姜和香附共同具有的化合物。耿威等[20]在实验中得出结论表明槲皮素可以降低胃癌细胞增殖和并延缓其侵袭正常的细胞，这些功能可能是通过调节Cav-1蛋白的表达来实现的。另有研究表明槲皮素能升高Caspase-3和Caspase-9的活性，进而抑制胃癌MKN45细胞增殖并诱导其凋亡[21]。王晓燕等[22]在实验中发现槲皮素可能通过下调MMP-2基因的表达进而明显降低胃癌BGC-823细胞的侵袭能力。张灿灿等[23]通过实验得出结论，槲皮素和si-FSCN1联合可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化进而达到抑制胃癌细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。有研究通过实验表明槲皮素联合伊马替尼可能通过调控Caspase-9和Caspase-3的表达进而抑制胃癌细胞的生长并诱导其凋亡[24]。有研究显示槲皮素可能通过阻滞SGC-7901细胞周期于S期来达到抑制胃癌细胞增殖[25]。

木犀草素是一种黄酮类化合物，它存在于蔬菜、中药和水果等植物中。有国外研究表明，它可以治疗多种恶性肿瘤，例如胃癌、肺癌、乳腺癌等，其作用机制可能通过不同的信号通路诱导肿瘤细胞的凋亡，在体内外阻断肿瘤的发展。Lu等[26]认为木犀草素可能通过MAPK和PI3K信号通路对胃癌细胞的增殖进行双重抑制。李艳红等[27]通过实验得出木犀草素体外抗胃癌肿瘤的主要机制可能是通过改变细胞周期分布和诱导其凋亡。有研究表明木犀草素可能通过阻滞细胞周期和线粒体途径来诱导胃癌MGC803细胞的凋亡[28]。王鹏等[29]认为木犀草素通过调节MMP-7蛋白表达进而抑制胃癌HGC-27细胞的迁移能力。

现代药理学研究表明，穿山龙总皂苷是穿山龙发挥药理作用的主要活性成分，其在抗肿瘤、调节免疫和消炎镇痛等方面具有较明显的作用[30]。薯蓣皂苷元可以调控miR-34a，下调E2F1、E2F3及CCND1基因表达，从而降低胃癌细胞的增殖、克隆，并抑制其迁移及侵袭等功能[31]。霍中华等[32]在研究中发现，薯蓣皂苷元能够降低内皮细胞增殖活性并且减少肿瘤血供，同时还直接作用于胃癌细胞减少其迁移。有研究表明薯蓣皂苷元能够影响人胃癌BGC-823与SGC-7901细胞的异型性、扩散与转移等多个方面，其作用机制可能是作用于MAPK通路中的p-p38通路[33]。何忠梅等[34]采用MTT比色法进行研究发现薯蓣皂苷元具有抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡的作用，但其细胞周期未受到明显的影响。

以上各类化合物通过不同方式来抑制胃癌细胞增殖、促进其凋亡、抑制胃癌細胞侵袭能力等达到对胃癌的治疗效果。

3.2 药物作用靶点

通过对87个靶蛋白进行PPI分析发现，AKT1、MYC、CASP3、EGFR等30个核心靶蛋白度，表明这些靶蛋白在新加良附方治疗胃癌过程中发挥着关键的作用，揭示了此方治疗胃癌可能的作用机制为抑制胃癌细胞增殖、促进其凋亡等。余南荣等[35]在实验发现，影响胃癌细胞的生物学行为是通过LncRNA CCAT1调控MYC蛋白表达激活MAPK信号通路而实现，LncRNA CCAT1可以诱导胃癌细胞凋亡，并且抑制其侵袭和迁移。还有研究表明胃癌细胞的增殖和凋亡是通过miRNA-490-3p直接靶向AKT1进行调控[36]。有的学者认为胃癌病因可能是细胞凋亡的非正常降低及增生过度导致的，其机制是CASP-3低表达和bcl-xl的高表达[37]。杨俊娥等[38]通过免疫组织化学的实验方法研究得出，胃癌的发生与ALDH1A1和EGFR在胃腺癌组织内异常表达有关，这2个靶点在胃癌的发生过程中起到协同的作用。

以上研究说明，靶点AKT1、MYC、CASP3、EGFR有抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡、调控蛋白表达等作用，对于胃癌的治疗有重要意义。

3.3 核心靶点的富集分析

GO功能富集分析结果显示，新加良附方治疗胃癌主要涉及受体活性、蛋白结合、酶活性调节、转录因子活性等方面，说明新加良附方治疗胃癌是一个十分复杂的生物学过程。

KEGG富集分析可见，新加良附方治疗胃癌的重要信号通路包括PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Wnt信号通路等多种信号通路。徐江江等学者通过实验得出，异常激活PI3K/Akt信号通路可能导致其在胃癌干细胞中的高表达，进而引起胃癌的发生[39]。有研究发现胃癌的发生是由PI3K/AKT/mTOR信号通路参与，其作用机制与PTEN在胃癌细胞组织中低表达，p-AKT和p-mTOR在胃癌组织中高表达有关[40]。刘豪杰等[41]发现胃癌细胞自噬水平和细胞凋亡可能与促进p53/AMPK/mTOR信号通路表达有关。Song等[42]认为TNF-α通过激活Wnt/β-cateni/TCF信号通路进而诱导胃癌细胞中Wnt10a和Wnt10b的表达，导致胃癌发生。故新加良附方治疗胃癌的主要通路可能为PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Wnt信号通路等，可能通过蛋白结合、转录因子活性、酶活性调节、受体活性等来治疗胃癌。

4 结语

本文通过网络药理学的研究方法，对新加良附方中“寒凝血瘀”病机采用温阳散寒化痰法治疗胃癌的有效活性成分、关键靶点、作用机制及可能的关键通路做了初步探讨。结果显示，新加良附方治疗胃癌过程中较为重要的成分可能是高良姜素、槲皮素、木犀草素、薯蓣皂苷元等，可能主要是通过MYC、AKT1、CASP3、EGFR等靶点来达到治疗目的，主要通路可能为PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、Wnt信号通路等，可能通过蛋白结合、转录因子活性、酶活性调节、受体活性等来治疗胃癌，说明新加良附方通过多成分、多靶点、多途径产生协同治疗胃癌的作用，体现了中医学整体性的特点。但是，本研究主要是通过数据库和网络药理学探讨新加良附方治疗胃癌的作用机制，具有一定的理论局限性，有待后续学者通过实验研究对其机制进行验证。

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（2021-01-05收稿 责任编辑：徐颖）