基于线粒体功能特性研究健脾益气摄血方调控ITP乏力机制

南凌杉 张雅月 王佳 丁晓庆 郭明 谌海燕 刘军霞 李玲 陈信义 郎海燕

摘要 目的：驗证健脾益气摄血方缓解ITP乏力症状与改善线粒体功能的相关性。方法：通过被动免疫造模法建立ITP小鼠模型，分为正常组、模型组、强的松组、健脾益气摄血（JPYQSX）中、高剂量组。通过光谱法检测小鼠脾脏组织活性氧含量;通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测线粒体DNA相对拷贝数;通过免疫荧光法检测结肠ATP含量。结果：与正常组比较，模型组（P<0.01）、强的松组（P<0.05）、健脾益气摄血各剂量组（P<0.01）小鼠脾脏组织ROS含量增多，脾脏组织线粒体DNA相对拷贝数明显下调（P<0.01），结肠组织ATP含量明显下调（P<0.01）;与模型组比较，强的松组、健脾益气摄血各剂量组小鼠脾脏组织ROS含量减少，脾脏组织线粒体DNA相对拷贝数比较无统计学意义（P>0.05），结肠组织ATP含量均显著升高（P<0.01）。结论：健脾益气摄血方可通过改善线粒体功能来有效缓解ITP乏力症状。

关键词 免疫性血小板减少症;乏力;健脾益气摄血;线粒体;线粒体功能;活性氧含量;线粒体DNA;ATP含量

Study on the Mechanism of Jianpi Yiqi Shexue Prescription on Regulating ITP Related Fatigue Based on Mitochondrial Functional Characteristics

NAN Lingshan1，ZHANG Yayue2，Wang Jia3，DING Xiaoqing1，GUO Ming1，CHEN Haiyan1，LIU Junxia1，LI Ling1，CHEN Xinyi2，LANG Haiyan1

（1 Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 2 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 3 Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450003，China）

Abstract Objective：To verify the correlation of the Jianpi Yiqi Shexue Formula in relieving ITP related fatigue and improving mitochondrial function.Methods：ITP mice model was established by the passive immunization mode method and divided into a normal group，a model group，a prednisone group，a Jianpi Yiqi Shexue Formula of medium and high dose group.The reactive oxygen content in mouse spleen tissue was detected by spectroscopy; the relative copy number of mitochondrial DNA was detected by real-time fluorescent quantitative PCR （qPCR）; the ATP content in colon was detected by immunofluorescence.Results：Compared with the normal group，the content of ROS in spleen tissue of mice increased，the relative copy number of mitochondrial DNA in spleen tissue was significantly down-regulated （P<0.01），and the content of ATP in colon tissue was significantly down-regulated （P<0.01） in the model group （P<0.01），in the prednisone group （P<0.05），the Jianpi Yiqi Shexue Formula of each dose group （P<0.01）; compared with the model group，the content of ROS in spleen tissue of mice in the prednisone group （P<0.05），and the Jianpi Yiqi Shexue Formula of each dose group decreased，and the relative copy number of mitochondrial DNA in spleen tissue showed no statistical difference.Conclusion：Jianpi Yiqi Shexue Formula can effectively relieve ITP related fatigue by improving mitochondrial function.

Keywords Immune thrombocytopenia; Fatigue; Jianpi Yiqi Shexue; Mitochondrial; Mitochondrial function; ROS content; Mitochondrial DNA; ATP content

中图分类号：R285.5;R558+.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.03.002

免疫性血小板减少症（Immune Thrombocytopenia，ITP）患者乏力症状是该病治疗中亟待解决的关键问题，且长期持续的乏力会严重影响ITP患者生命质量，甚至导致患者情绪低落而发生焦虑事件。但迄今为止，对于导致ITP患者乏力原因尚无明确认识和有效治疗措施。

线粒体作为人体细胞的“能量制造厂”，为细胞进行各种生命活动提供能量支持[1-2]。线粒体作为调控细胞能量代谢、生物合成及细胞衰亡的重要细胞器，其功能异常在许多疾病和病理状态的发生和发展过程中起着重要作用[3]。本研究通过被动免疫造模法建立ITP小鼠模型，以模型小鼠脾脏组织活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）含量、线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）相对拷贝数，以及结肠组织（重要免疫器官）ATP含量为观察指标，试图验证健脾益气摄血方提升缓解ITP小鼠乏力症状与改善线粒体功能的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级BALB/c小鼠120只（编号：D12，体质量18～22 g，8周龄，雌雄各半），购于第四军医大学实验动物中心，许可证号：SCXK（陕）2014-002，SPF级实验室IVC鼠笼中饲养。豚鼠24只，体质量250 g，雌雄各半，购于兴平市天瑞实验动物养殖厂，许可证号：SCXK（陕）2012-001，普通环境饲养。动物实验操作按中国动物保护协会指导方针进行，符合有关动物伦理学要求（伦理审批号：XYLS2019069）。

1.1.2 药物 健脾益气摄血方（黄芪、党参、茯苓、白术、阿胶、茜草、炙甘草）由西安星华药物研究所按照中药新药制备工艺标准制备并提供，中剂量浓度1 mL药液含生药1.17 g，高剂量浓度为中剂量浓度2倍;强的松（上海晶纯生化科技股份有限公司，货号：C16286550）。

1.1.3 试剂与仪器 冰冻切片活性氧（ROS）检测试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，型号：HR7814）;ATP含量检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，型号：S0026）;BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所，型号：P0012）;蔗糖（Sigma公司，美国，批号：V900116）;O.C.T Tissue-Tek（SAKURA公司，美国，批号：4583）;酚，氯仿（Sigma公司，美国，批号：C2432）;异丙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号：I811925）;乙酸鈉（Sigma公司，美国，批号：S2889）;无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司，批号：0012036210）。全自动波长酶标仪（Bio-Tek公司，美国，型号：ELX800）;台式高速匀浆机（POLYTRON公司，美国，型号：PT1600E）;赛默飞冰冻切片机（Thermo Fisher Scientific公司，美国，型号：NX50）;mini离心机（Eppendorf公司，美国，型号：5420）、小型高速冷冻离心机（Eppendorf公司，美国，型号：5910R），微量高速离心机（长沙湘仪公司，型号：H1650-W）;超纯水系统（Millipore Synergy UV公司，德国，型号：IQ7003）;精密pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司，型号：PHSJ-4A）;电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司，型号：DK-8D）;4 ℃冰箱（海尔公司，型号：HYCD-205）;-80 ℃冰箱（Thermo Fisher Scientific，美国，型号：TLE40086）;制冰机（GRANT公司，美国，型号：XB70）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 取90只雌雄各半小鼠，尾静脉断尾取血，全自动动物血液分析仪检测PLT计数后随机分为5组，每组18只，分别为正常组、模型组、强的松组、健脾益气摄血（JPYQSX）中、高剂量组。按照经典被动免疫造模法制备抗小鼠血小板血清。制备步骤如下：BALB/c小鼠麻醉取抗凝全血，梯度离心（1 100 r/min，10 min;3 000 r/min，10 min，离心半径：6 cm）后得到血小板。血小板用PBS洗涤2次，重悬，调整浓度至2.5×106/mL，与等量完全福氏佐剂和不完全福氏佐剂混匀作抗原。其中，以含完全福氏佐剂抗原于0周注射于豚鼠足掌、背及皮下，共5点，合计1 mL;以含不完全福氏佐剂抗原分别于1、2、4周按上述相同部位与点数注射。第5周从豚鼠心脏取不抗凝全血，离心分离血清，即得豚鼠抗小鼠血小板血清（GP-APS）。56 ℃灭活补体，红细胞吸附，最后用生理盐水稀释成1∶4浓度APS备用。然后进行模型制备，除正常组按100 μL/20 g每天注射生理盐水外，其余各组均按100 μL/20 g剂量腹腔注射APS，1次/d，重复至实验结束。

1.2.2 给药方法 从注射APS（造模）第8天开始，给药各组均按照0.1 mL/10 g体积药物灌胃，正常组、模型组给予0.1 mL/10 g生理盐水，1次/d。给药8 d后处死小鼠，立即取同一部位大小约1 cm×1 cm×1 cm的脏器组织，将取出的脏器组织分为3份，一部分加入线粒体保护液后冻存于-80 ℃;一部分加入4%多聚甲醛固定液固定;另一部分直接-80 ℃冻存，待测。取脾脏和结肠组织用于此实验。

1.2.3 检测指标与方法 ROS含量检测：用ddH2O将O13活性氧荧光探针100～200倍稀释，配成染色工作液，将10×清洗液10倍稀释配成1×清洗液工作液。组织取材后迅速放入4%PFA（多聚甲醛）固定液中混匀，放置4 ℃冰箱固定24～48 h，PBS洗涤后加入30%蔗糖溶液中放置4 ℃冰箱，待组织沉入管底则说明脱水完成。OCT冰冻包埋剂包埋，赛默飞冰冻切片机切片10 μm。使用新鲜组织制成冰冻切片，室温中滴加200 μL清洗工作液，静置3～5 min。吸除清洗液后滴加100 μL的染色工作液，置于湿盒中37 ℃培养箱避光孵育20～60 min。移除染色工作液，PBS洗涤后加盖玻片后，立即荧光显微镜进行荧光定性分析（激发波长为535 nm，发射波长为610 nm）、拍照。使用ImageJ软件进行定量分析。

线粒体DNA（mtDNA）相对拷贝数检测：将剪碎的组织，按100∶1加入裂解液与ProteinK，56 ℃水浴8 h。加入等体积的酚：氯仿：异戊醇，剧烈震荡后室温静置3 min。13 000 r/min 4 ℃离心10 min，离心半径：6 cm，离心后上层含DNA水相。将上层水相转移至1.5 mL EP管中，加入1/10体积乙酸钠和预冷等体积无水乙醇，颠倒混匀，-20 ℃放置30 min。再次以上法离心后取得核酸沉淀。弃上清，将EP管倒置，加高压水配置70%乙醇600 μL，13 000 r/min离心10 min，离心半径：6 cm。弃去残余乙醇，65 ℃干燥20～25 min。根据DNA的量不同加入不同体积的预热高压水溶解DNA，测DNA浓度。DNA样品浓度调成50 ng/μL。将SYBR Green从-20 ℃取出，置于冰上避光溶解，目的基因和内参基因的正反引物均用ddH2O溶解为100 μmol/L，并稀释成10 μmol/L的工作液。qPCR反应体系与反应引物详见表1、表2。在qPCR专用96孔板中加入目的基因和内参基因体系，每孔18 μL，每孔加入样品DNA2 μL。qPCR专用膜将96孔板密封，1 000 r/min 4 min水平离心机离心，离心半径：6 cm。上机，设置qPCR程序：线粒体DNA拷贝数，第一步：95 ℃，10 s;第二步：95 ℃，5 s;58 ℃，30 s，循环40次。结果导出，通过2-△△Ct法计算线粒体DNA拷贝数，以ND1代表线粒体编码的基因，GAPDH则代表核基因作为内参对照。

ATP含量检测：按照每20 mg组织加入约100～200 μL裂解液的比例加入裂解液，后以高速匀浆机匀浆。将裂解后的样品于4 ℃，12 000×g离心5 min。用ATP检测裂解液稀释ATP标准溶液，设置浓度梯度为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10 μmol/L。以ATP检测试剂：ATP检测试剂稀释液=1∶9稀释制成ATP检测工作液，每个样品对应100 μL的ATP检测工作液（100 μL）加入检测孔，室温下放置3～5 min消耗本底。检测孔中加入20 μL样品，迅速混匀，间隔3 s，使用化学发光仪测定样品的RLU值（Relative Light Unit，RLU），依据设置的标准曲线计算样品的ATP浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，其中计数资料以（%）表示，采用χ2检验，计量资料以（±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 結果

脾脏组织活性氧（ROS）含量变化：O13是一种具有细胞膜通透性的荧光探针，可以被小鼠脾脏组织中的ROS特异性地氧化生成红色荧光物质。红色荧光的强度与ROS水平成正比，通过使用荧光显微镜测试红色荧光可以判断脾脏组织内ROS表达水平。小鼠脾脏组织ROS含量变化见图1。

如图1F所示，正常组小鼠脾脏组织中荧光染色阳性率为2.33%，模型组为19.62%，强的松组为4.71%，健脾益气摄血中剂量组为12.7%、高剂量组为8.92%。与正常组比较，模型组（P<0.01）、强的松组（P<0.05），健脾益气摄血各剂量组（P<0.01）小鼠脾脏组织荧光染色阳性率均明显上调，差异有统计学意义。与模型组比较，强的松组、健脾益气摄血各剂量组小鼠脾脏组织ROS表达量明显下调，差异有统计学意义。其中，强的松组ROS含量低于健脾益气摄血高剂量组（P<0.05），高剂量组ROS含量低于健脾益气摄血中剂量组（P<0.05），差异有统计学意义。

脾脏组织线粒体DNA（mtDNA）相对拷贝数变化：线粒体DNA与核DNA拷贝数的比值，即mtDNA相对拷贝数，可以反映线粒体DNA的含量与细胞中线粒体的数量。线粒体DNA基因结构模拟见图2，ITP小鼠脾脏组织mtDNA相对拷贝数见图3。

图3可以看出：与正常组比较，模型组、强的松组、健脾益气摄血各剂量组小鼠脾脏组织线粒体DNA相对拷贝数均明显下调，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型对照组比较，用药各组小鼠脾脏组织线粒体DNA相对拷贝数比较无统计学意义（P>0.05）。

小鼠结肠组织ATP含量：由于肝脾等其他脏器裂解之后含有大量血细胞，上清颜色偏红，会引起发光法测量误差过大，故最终选用结肠组织检测。首先以ATP标准溶液检测0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、和10 μmol/L这几个浓度，制作标准曲线，测量得到样品相对发光值。样本检测值见表3，ITP模型小鼠结肠组织ATP检测标准曲线见图4，各组小鼠结肠ATP含量比较见图5。

从图5结果可以看出，与正常组比较，模型组、强的松组和健脾益气摄血中剂量组小鼠结肠组织ATP含量明显下调，差异有统计学意义（P<0.01）;健脾益气摄血高剂量组小鼠结肠组织ATP含量明显上调，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，用药各组小鼠结肠组织ATP含量均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01）。其中，健脾益气摄血高剂量组小鼠结肠组织ATP含量明显高于强的松组和健脾益气摄血中剂量组（P<0.01），强的松组与健脾益气摄血中剂量组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

健脾益气摄血方对脾脏组织ROS水平影响：活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）是线粒体呼吸链（Respiratory Chain，RC）氧化磷酸化过程中电子泄露的副产物，在病理条件下，许多因素均会引起ROS生成增多，导致脂质过氧化作用而破坏线粒体膜结构，从而导致ATP生成减少和氧化磷酸化功能受损，氧化磷酸化功能受损又会进一步促进ROS生成，从而形成了自体循环链式线粒体功能障碍[4-6]。多种疾病所伴随的乏力症状主要表现为运动耐力下降的疲劳感。有研究表明，这种疲劳感与肌肉组织中线粒体氧化磷酸化功能减弱有关[7-9]。还有研究报道，在慢性乏力症状患者体内检测到ROS水平升高以及线粒体功能异常表现[10-13]。

本次研究发现，ITP小鼠模型组脾脏组织ROS荧光染色阳性率明显高于正常组，结合既往对于ITP模型小鼠、斑马鱼出血模型乏力替代指标的前期研究结果[14-17]，表明ITP模型小鼠不仅表现有类似人类ITP乏力症状，其脾脏组织ROS含量也明显上调，这一结果提示ITP模型小鼠的线粒体功能受到破坏。经强的松、健脾益气摄血方中、高剂量治疗后，小鼠脾脏组织ROS荧光染色阳性率与模型组比较明显下调（P<0.01）。其中，强的松下调作用最为明显，健脾益气摄血高剂量组优于中剂量组。提示强的松，健脾益气摄血方中、高剂量均能下调ITP小鼠脾脏组织中ROS含量，有助于线粒体功能的恢复。参考既往健脾益气摄血方治疗ITP临床试验结果（缓解乏力症状）以及对乏力替代指标的改善作用[18-20]，说明ITP乏力与线粒体产生过多ROS或者清除障碍有一定相关性，健脾益气摄血方能够改善ITP乏力症状与减少脾脏组织线粒体ROS含量有关。

健脾益气摄血方对脾脏组织mtDNA相对拷贝数影响：线粒体DNA是裸露的环状或线性分子，不与组蛋白结合，具有突变率高（比细胞核DNA高10倍以上）和“母性遗传”特点。由于线粒体DNA编码部分细胞色素氧化酶亚基，故mtDNA异常可能会对线粒体氧化磷酸化过程造成影响，使ATP合成不足而导致疾病发生与进展[21]。既往研究发现，线粒体DNA功能异常与慢性病乏力症状发生过程有关，mtDNA异常可能会影响患者对肌痛性脑脊髓炎（慢性疲劳综合征）等疾病的易感性[22-25]。

线粒体DNA与核DNA拷贝数的比值，即mtDNA相对拷贝数，可以反映线粒体DNA的含量与细胞中线粒体的数量，是反映线粒体生物合成及功能状态的重要指标。线粒体ND1基因（MT-ND1）位于mtDNA小环，编码位于线粒体内膜的NADH脱氢酶亚单位1[26-28]。本研究以ND1基因代表mtDNA，以GAPDH代表核基因作为内参，采用qPCR技术检测ND1相对拷贝数，观察ITP模型小鼠mtDNA的拷贝情况，是目前国内外较为常用的一种检测线粒体DNA含量的实验方法。在本研究的前期实验中已证实，在被动免疫造模法建立ITP模型后，模型组小鼠出现了反应迟钝，活动能力下降，进食量减少，竖毛，便溏，或血便等类似“脾气虚弱”引起的乏力症状。与此同时，模型组小鼠脾脏mtDNA相对拷贝数明显减少，说明被动免疫法复制的ITP造模对小鼠脾脏线粒体功能有不同程度的损害。经强的松、健脾益气摄血方治疗后，小鼠脾脏mtDNA相对拷贝数并没有上调的原因，考虑系治疗时间较短，小鼠脾脏线粒体功能尚不能得到完全修复;也可能是因为健脾益气摄血方并不是通过提高脏器线粒体DNA相对拷贝数（mtDNA含量）来改善小鼠脏器线粒体功能的。

健脾益气摄血方对结肠组织ATP含量影响：腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）是生物体内最直接的能量来源，80%的ATP产生来自氧化磷酸化。早在20世纪90年代就已经发现，大鼠骨骼肌中ATP水平下降与疲乏程度之间具有明显线性关系[29-30]。由于肝脾等其他脏器裂解之后血细胞成分含量较大，匀浆的上清颜色偏红，会引起发光法测量误差过大，故在本实验中最终选用结肠组织检测。研究结果发现，与正常组比较，模型组、强的松组和健脾益气摄血中剂量组小鼠结肠组织中ATP含量明显下降（P<0.01），说明ITP造模成功后，ITP模型小鼠结肠组织的ATP水平也随之显著下降。与模型组比较，给药各组小鼠ATP含量明显上调（P<0.01）。其中，健脾益气摄血高剂量组小鼠结肠组织ATP含量明显高于强的松组和健脾益气摄血中剂量组，差异有统计学意义（P<0.01），即以健脾益气摄血高剂量组上调ATP含量的作用最優。实验结果证明，健脾益气摄血方可以改善ITP小鼠结肠组织线粒体功能，提高小鼠结肠组织中ATP水平，并能够有效缓解ITP小鼠的乏力症状。

综合上述研究结果，可以得出如下结论：经被动免疫造模法建立的ITP小鼠模型具有类似“脾气虚弱”的乏力症状，同时线粒体功能也明显受损。健脾益气摄血方可以通过改善ITP小鼠线粒体功能使乏力症状得到缓解。

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（2021-01-05收稿 責任编辑：徐颖）