CSMD1突变在食管癌预后及浸润免疫细胞中的价值

向玲，彭玲珑

(重庆医科大学附属第二医院，重庆 400000)

0 引言

食管癌是一种发生率及死亡率较高的肿瘤，免疫治疗对食管癌的治疗价值有限[1]。肿瘤突变负荷是指每百万个碱基中检测到的体细胞基因编码错误、基因插入、缺失及替代的碱基总数[2]。在癌症的发生和发展过程中，大量的体细胞突变积累在肿瘤细胞中产生新抗原，这种新抗原可以被患者的免疫系统识别[3]。因此，肿瘤突变负荷可作为肿瘤免疫治疗应答反应的独立生物标志物[4]，但是，目前尚不清楚与肿瘤突变负荷相关高突变频率的基因在食管癌预后及浸润免疫细胞中的作用。本研究拟系统性评估肿瘤突变负荷相关基因在食管癌预后及浸润免疫细胞中的价值。

1 方法

1.1 数据采集

美国食管癌患者的转录组数据、体细胞突变数据以及临床数据来源于TCGA数据库(http：//portal.gdc.cancer.gov/projects)。中国食管癌患者的体细胞突变数据来源于ICGC(http：//dcc.icgc.org/releases/current/Projects)数据库。

1.2 肿瘤突变负荷的定义

肿瘤突变负荷为每兆碱基中引起氨基酸变化的突变碱基总数。通过肿瘤突变负荷的计算公式计算每个TCGA食管癌样品中肿瘤突变负荷的表达值[2]。

1.3 生物信息学分析

生物信息学分析均通过R软件(v4.0.2)完成。使用Perl软件分别提取了TGCA和IGGC数据库中突变频率最高的30个基因。通过R包“venn”在获取两个数据库中的高突变频率的交叉突变基因。使用R包“ggpubr”评估并可视化这些交叉突变基因与TMB之间的关系。使用CIBERSORT反卷积算法，将过滤条件设置为P＜0.05，获得每个TCGA数据库中食管癌样品的免疫细胞比例的矩阵数据。根据CSMD1的突变状态，将TCGA样品分为野生组和突变组。两组之间浸润免疫细胞的差异分析通过R软件包“limma”进行，并通过R软件包“vioplot”进行可视化。

1.4 统计学分析

使用Kaplan-Meier生存曲线分析对与肿瘤突变负荷相关的突变基因进行预后分析。通过未配对t检验评估CSMD1突变型组和CSMD1野生型组浸润免疫细胞的差异。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 食管癌的体细胞突变特征

TCGA数据库182例食管癌样本突变数据分析显示：错义突变为食管癌患者最主要的突变形式，排名前5位的突变基因分别是 TP53，TTN，MUC16，CSMD3及 SYNE1(图 1A)。ICGC数据库297例食管癌样本突变数据分析显示：中国患者中普遍发生错义突变，其中TP53，TTN，MUC16，NOTCH1和CSMD3基因在中国患者中的突变频率位居前5位(图1B)。

2.2 鉴定与食管癌肿瘤突变负荷相关的突变基因

将TCGA及ICGC数据库中突变频率最高的前30个基因取交集，获取两个数据库中共同突变基因。结果显示：具有高突变频率的共同突变基因共18个基因(图2A)。根据这18个交叉突变基因的突变状态，将来自TCGA数据库中食管癌患者分为野生组和突变组。通过对基因突变矩阵和TMB表达矩阵数据行整合分析，结果显示：18个共同突变基因中，其中10个基因的肿瘤突变负荷表达量在野生组及突变组之间差异明显，均具有统计学意义(P＜0.05)(图2B)。与肿瘤突变负荷相关的突变基因分别是TNN，MUC16，CSMD3，PCLO，LRP1B，SYNE1，RYR2，USH2A，CSMD1和 SPTA1基因 (图 2B)。

2.3 CSMD1突变与食管癌预后相关

根据筛选出的10个与肿瘤突变负荷相关的突变基因的突变状态，将TCGA数据库中的食管癌患者分为野生组和突变组，并结合患者生存数据进行Kaplan-Meier生存分析。结果显示，10个与肿瘤突变负荷相关的突变基因中，只有CSMD1突变与食管癌预后相关。CSMD1突变型的患者预后更差，CSMD1野生型的患者预后更好，差异具有统计学意义 (P=0.029)(图 3)。

2.4 食管癌中与CSMD1突变相关的浸润免疫细胞

根据CSMD1基因的突变状态，将TCGA数据库中食管癌患者分为CSMD1野生型组和CSMD1突变型组，使用CIBERSORT反卷积算法，计算两组之间浸润免疫细胞含量。结果显示：与CSMD1野生型组患者相比，CSMD1突变型组患者的激活记忆CD4 T细胞及激活NK细胞的浸润比例更高，差异具有统计学意义(图4)。

3 讨论

图3 10个与肿瘤突变负荷相关的突变基因的生存曲线

图4 CSMD1突变型组与野生型组患者之间22种浸润免疫细胞的含量

食管癌在我国癌症发病率中位居第四位。目前其治疗方式包括手术、内镜、化疗、靶向及免疫治疗等多种治疗方式[1]。免疫治疗主要针对晚期食管癌患者，其疗效尚处于探索阶段。CSMD1基因是新近发现的一个抑癌基因，其表达缺失或功能异常与人类多种肿瘤的发生进展密切相关。目前已经证实CSDM1作为黑素瘤细胞中的抑癌基因，可通过与Smad3相互作用，激活Smad1、Smad2和Smad3，在黑素瘤细胞中发挥抗肿瘤作用[5]。一项对来自头颈部、肺、乳腺和皮肤的原发性肿瘤的基因拷贝数进行表征的研究表明，这些癌症中均或多或少存在CSMD1表达丢失及功能缺失[6]。与正常的乳腺导管上皮细胞相比，乳腺浸润性导管癌中CSMD1的表达降低，且其低表达与肿瘤分级及患者总体生存率相关[7]。在对结直肠癌突变基因分析中，Farrell等人确定了5个CSMD1非同义体细胞突变，且这些突变主要发生在晚期结直肠肿瘤中，提示CSMD1突变在晚期转移性疾病发展中可能发挥重要作用[8]。在本研究中，我们的结果显示，CSMD1突变不仅在食管癌中普遍发生，且与肿瘤突变负荷及患者预后密切相关。肿瘤突变负荷可作为判定肿瘤免疫治疗应答反应的生物标志物，因此，我们进一步分析了CSMD1突变型及野生型患者中浸润免疫细胞含量，结果显示，与CSMD1野生型组患者相比，CSMD1突变型组患者的激活记忆CD4 T细胞及激活NK细胞的浸润比例更高。CD4 T细胞又称为辅助性T细胞，主要通过分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2等细胞因子，介导细胞免疫，增强NK细胞和细胞毒性T细胞的杀伤能力，从而发挥抗肿瘤作用[9]。而在晚期肿瘤中，肿瘤细胞会自发性下调MHC-Ⅰ分子的表达来逃脱CD8 T细胞的杀伤作用情况，机体可通过不依赖MHC-Ⅰ作用形式的NK细胞作为杀伤肿瘤细胞的主力军[10]。因此，我们推测，CSMD1突变型组患者中高浸润比例的激活记忆CD4 T细胞及激活NK细胞，有助于食管癌的抗肿瘤免疫治疗。综上，CSMD1突变可以作为预测食管癌预后及免疫反应的生物标志物。